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koko1210

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[交流] 模板濃度高會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄結(jié)果嗎?

我用同一種的模板，做了兩次反轉(zhuǎn)錄，第一次加10微升模板，40微升反轉(zhuǎn)錄體系；第二次加15微升模板，同樣試劑盒，40微升反轉(zhuǎn)錄體系。然而第二次反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA濃度比第一次還要低，很奇怪。
我知道模板濃度高會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄效率，但是怎么還會(huì)降低cDNA的濃度？我總認(rèn)為如果模板濃度過(guò)高，反轉(zhuǎn)不下去，也就達(dá)到40微升體系中CDNA的最大濃度，不知這個(gè)想法是否是錯(cuò)誤的？請(qǐng)各位多指教```

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西瓜

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1樓 2012-03-14 19:55:04

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koko1210

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-14 22:28:20:
加模板不是要看體積，要看RNA的量哦。反轉(zhuǎn)錄試劑盒上會(huì)有關(guān)于RNA模板用量的說(shuō)明，可參考下。不知道你用了多少RNA，所以不好說(shuō)。RNA過(guò)量至少帶來(lái)2個(gè)問(wèn)題：
1.反轉(zhuǎn)錄酶能力有限，RNA過(guò)量會(huì)造成反轉(zhuǎn)錄不完全，就是說(shuō) ...

明白了，非常感謝！

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3樓2012-03-15 17:57:05

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西瓜

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wanhscn(金幣+8, MolEPI+1): very good! 授予專(zhuān)家指數(shù)！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26

加模板不是要看體積，要看RNA的量哦。反轉(zhuǎn)錄試劑盒上會(huì)有關(guān)于RNA模板用量的說(shuō)明，可參考下。不知道你用了多少RNA，所以不好說(shuō)。RNA過(guò)量至少帶來(lái)2個(gè)問(wèn)題：
1.反轉(zhuǎn)錄酶能力有限，RNA過(guò)量會(huì)造成反轉(zhuǎn)錄不完全，就是說(shuō)有的RNA沒(méi)能反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如果用來(lái)定量，結(jié)果就會(huì)不準(zhǔn)確。
2.提取RNA的過(guò)程中使用的試劑會(huì)影響酶活性，所以體積不能加太多，一般不要超過(guò)反轉(zhuǎn)錄體系的1/10（具體請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書(shū)）。

另外，測(cè)cDNA濃度是很奢侈的行為。反轉(zhuǎn)錄酶那么貴，cDNA是很珍貴的，不要浪費(fèi)。一般的做法是測(cè)RNA濃度，然后不同樣品都使用同樣量的RNA去做反轉(zhuǎn)錄，這樣得到的不同樣品的cDNA就可以認(rèn)為濃度是一樣的。

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koko1210

2樓2012-03-14 22:28:20

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華曄-123

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koko1210(金幣+1): 謝謝參與

模板濃度確實(shí)會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄的效率，而且一般試劑盒說(shuō)明上也會(huì)表明RNA不超過(guò)的量，一般不超過(guò)1ug....

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5樓2012-03-22 13:31:23

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