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zhoujiang09新蟲 (初入文壇)
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[交流]
RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄加模板問題 已有4人參與
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| 請(qǐng)問各位同仁，我現(xiàn)在要做逆轉(zhuǎn)錄PCR，我做逆轉(zhuǎn)錄之前測得RNA的濃度是340ng/ul，我按照fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求要從中取1ugRNA做逆轉(zhuǎn)錄，我先拿1000/RNA的濃度=2.94，是不是我取2.94ulRNA的量就相當(dāng)于1ng RNA啊？還有，我取2.94ulRNA的話，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，是不是只要調(diào)整水的量使反應(yīng)體系不變就可以了啊？Sample Text |
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 【分子生物】EPI帖 | 分子實(shí)驗(yàn) |
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2樓2012-04-03 10:46:21
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小丹木木: 金幣+2, MolEPI+1, 西瓜斑斑很專業(yè)的說 2012-04-05 11:30:43
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+2, MolEPI+1, 西瓜斑斑很專業(yè)的說 2012-04-05 11:30:43
樓上說得不錯(cuò)了。我補(bǔ)充下 “是不是只要調(diào)整水的量使反應(yīng)體系不變就可以了��？”這個(gè)的前提是RNA的體積不要超過反轉(zhuǎn)錄體系的1/10。因?yàn)樘崛NA用的試劑里有很多可以抑制酶活性的成分，如果RNA體積過多，殘余的東東會(huì)抑制反轉(zhuǎn)錄的。試劑盒說明書上應(yīng)該有提到這點(diǎn)，一般就是不超1/10。 萬一加1ug的2.94uL已經(jīng)超過了1/10體積怎么辦捏？沒關(guān)系，減少RNA用量就可以了。試劑盒上說的1ug應(yīng)該是RNA用量的上限，告訴你不要用超過這個(gè)量的RNA，否則反轉(zhuǎn)錄酶活性有限會(huì)不能把全部RNA都反轉(zhuǎn)錄成cDNA，這樣定量就不準(zhǔn)確了。并不是說少于這個(gè)量的RNA就不能做。你用500ng、100ng都是可以的，具體參照試劑盒上的說明，應(yīng)該還有提到RNA用量的下限。 如果你是做定量，那么盡量所有樣品都使用同樣量的RNA來做反轉(zhuǎn)錄吧，這樣得到的cDNA的濃度就是一樣的了。結(jié)合你所有樣品的RNA濃度，然后在試劑盒說明的RNA用量上下限之間取一個(gè)合適的值，讓所有樣品使用的RNA體積都小于1/10，這樣就ok了。 |
3樓2012-04-03 12:26:10
zhoujiang09
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我上周做了這個(gè)點(diǎn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，RNA濃度是340ng/ul，逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候我取了1ul，擴(kuò)增出來的cDNA再PCR,產(chǎn)物還跑得不錯(cuò)，沒有引物二聚體，也沒有非特異性擴(kuò)增。我準(zhǔn)備上熒光定量了。
西瓜4樓2012-04-03 13:05:04
西瓜
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8樓2012-04-04 00:33:16
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