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h411470316鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
瓊脂糖電泳沒有條帶，但是DNA濃度很高，1000+ng/ul maker有條帶
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| Sample Text本人最近幾次PCR產(chǎn)物跑膠總是沒條帶，操作和以往經(jīng)驗(yàn)一樣，用1%的TBE瓊脂糖凝膠電泳，跑25分鐘左右，但是一直都沒有條帶，maker可以正常跑出，目的片段是750bp左右的片段，換了人操作，結(jié)果也是一樣，但是測(cè)PCR產(chǎn)物DNA濃度的時(shí)候又有約1000+ng/ul，這是什么情況啊，求各位高人分析指點(diǎn)，小弟不甚感激�。�！ |
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atlanticwi
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嗯..................... 說實(shí)話，你這個(gè)操作是個(gè)失誤哦，你測(cè)PCR產(chǎn)物是通過分光光度法測(cè)定的嗎？如果是，絕對(duì)不能這么操作的啊，原因有以下： 1. 你如何調(diào)Blank，PCR體系混雜，難道你要再配一管沒模板的PCR混合液去調(diào)Blank的嗎？ 2. PCR都是成指數(shù)（理想狀態(tài)）擴(kuò)增，數(shù)十個(gè)循環(huán)的正常PCR產(chǎn)物去測(cè)光密度，可能都會(huì)暴表了。 3. 分光光度法又沒法分辨你的產(chǎn)物和其他類型核酸的，所以你的引物在里邊也會(huì)正常讀出來的 所以確定有沒有PCR產(chǎn)物只能是電泳或熒光定量的方法來檢驗(yàn) 祝實(shí)驗(yàn)順利，若有說錯(cuò)請(qǐng)高手指正哦  |
2樓2012-04-07 23:36:00
wtyyyyy1988
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5樓2012-04-10 19:57:58
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針對(duì)你這種情況，我也明白你為什么擴(kuò)不出來了，PCR是有模板量限制的，這很多人知道但不明白為什么。 舉個(gè)例子來說，為什么PCR到40多循環(huán)進(jìn)入平臺(tái)期后就不再有高擴(kuò)增效率，這并非是酶不強(qiáng)勁，現(xiàn)代重組工業(yè)生產(chǎn)的酶即使是在PCR循環(huán)后期仍舊活力很高。 同樣這也不是組份消耗過多的問題，如果你加入兩倍量dNTP、引物，到40循環(huán)左右仍舊會(huì)進(jìn)入平臺(tái)期，擴(kuò)增效率下降。 問題在哪里，是聚合酶有傾向于結(jié)合完整雙鏈的特點(diǎn)，如果退火條件稍差，模板-引物結(jié)合的趨勢(shì)仍會(huì)遜于模板模板相結(jié)合，造成其對(duì)聚合酶的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，所以初始模板過多和循環(huán)一定程度這兩種情況可以說是等同的。 所以，若你擴(kuò)不出來東西，首先嘗試調(diào)整條件，引物一般只要不是很夸張，一般PCR的應(yīng)用是沒有什么特異特異性的可言的 |
6樓2012-04-10 21:02:58
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7樓2012-08-22 18:21:39
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學(xué)習(xí)了 8樓2012-11-27 21:42:14
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