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含羞草liu新蟲 (小有名氣)
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[求助]
Oligo 6.0引物評(píng)價(jià)、兩溫度循環(huán)、PCR退火溫度的選擇問題
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我用CODEHOP法設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，對(duì)cDNA第一鏈進(jìn)行PCR。但用Oligo 6.0對(duì)引物評(píng)價(jià)時(shí)，在對(duì)PCR一項(xiàng)評(píng)價(jià)時(shí)，總會(huì)出現(xiàn)下面一句話： Comments: Two-temperature PCR recommended: (68°/94°) 查相關(guān)資料，得知這是說兩溫度循環(huán)PCR的條件可設(shè)為68°和94°。但對(duì)于兩溫度循環(huán)，我很不明白，將退火和延伸合并，設(shè)溫度為68°嗎？94度是指變性溫度嗎？時(shí)間要設(shè)多長(zhǎng)呢？什么情況下適合用兩種溫度循環(huán)呢？?jī)煞N溫度循環(huán)和正常PCR相比，有什么特別之處呢？ 還有，如果進(jìn)行正常的PCR，退火溫度的選擇是按照Oligo 6.0上的說明嗎？ 我設(shè)計(jì)的引物，Oligo 6.0上指示：Optimal Annealing Temperature: 60.3° (Max: 72.0°)，實(shí)際PCR時(shí)，我要怎樣選擇退火溫度呢？是60.3°，還是在60.3°－72.0°之間都可以？還是，選擇Comments里說的選擇68°？ 有關(guān)引物的評(píng)價(jià)和PCR條件，我不是很清楚，請(qǐng)大家?guī)蛡�(gè)忙，感激不盡！��！ |
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羽化姚俊鵬
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2樓2016-08-11 17:17:22
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