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johnny4890

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[求助] 提取RNA與做RT-PCR的問題

最近從霉菌中提取總rna，質(zhì)量不好，反轉(zhuǎn)錄老是做不出來，而且pcr的時(shí)候經(jīng)常把水那組p出條帶來==。請(qǐng)大家給我點(diǎn)意見。先看看我的總rna電泳圖。

（第一次）

（第二次）
所用的protocol是網(wǎng)上下載的山寨版本。如下：
RNA的提取
準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

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1樓 2012-04-30 20:17:04

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johnny4890: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-02 21:38:16

嗯................
我覺得，這樣的RNA肯定是不能用的，電泳結(jié)果顯示出你的RNA降解的比較嚴(yán)重，同樣有Smear的話，基因組DNA還是有污染的，網(wǎng)上的這個(gè)Protocol我看基本的操作沒有問題，主要是TRIzol試劑你是怎么配的呢，還是買的商業(yè)化TRIzol？同樣具體應(yīng)用到你菌的RNA提取上，不知道這個(gè)Protocol是否適用.............
個(gè)人看法若有說錯(cuò)請(qǐng)高手指點(diǎn)

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2樓: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-30 20:38:11:
嗯................
我覺得，這樣的RNA肯定是不能用的，電泳結(jié)果顯示出你的RNA降解的比較嚴(yán)重，同樣有Smear的話，基因組DNA還是有污染的，網(wǎng)上的這個(gè)Protocol我看基本的操作沒有問題，主要是TRIzol試劑你 ...

TRIzol是買的商業(yè)化的。你們提rna的時(shí)候有專門的操作臺(tái)嗎？

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3樓2012-04-30 20:47:45

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3樓: Originally posted by johnny4890 at 2012-04-30 20:47:45:
TRIzol是買的商業(yè)化的。你們提rna的時(shí)候有專門的操作臺(tái)嗎？

嗯
我們一般在超凈臺(tái)中操作 RNA的處理要小心換手套 ep管槍頭均要DEPC處理過才比較放心

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4樓2012-04-30 20:49:31

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4樓: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-30 20:49:31:
嗯
我們一般在超凈臺(tái)中操作 RNA的處理要小心換手套 ep管槍頭均要DEPC處理過才比較放心

這些用具我都是買的rna操作專用的，就是那個(gè)超凈臺(tái)做什么操作的都有，沒有專用的。。。

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5樓2012-04-30 21:23:02

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畢業(yè)設(shè)計(jì)一直在做這個(gè)工作，只不過我提的是植物的。還是DEPC處理過比較放心，雖然比較麻煩。貌似RNA降解的比較厲害，試試用試劑盒提提，或許有幫助。

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6樓2012-05-01 14:44:26

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你買的RNA專用的，最好也要在DEPC水里面泡一下，再滅后使用。細(xì)胞最好是用液氮研磨。第9步棄完上清，在把空管離一下。跑膠是將RNA稀釋到40倍左右，你再試試。

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任重道遠(yuǎn)……

7樓2012-05-02 10:36:25

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DEPC處理操作器具，離心管槍頭等很重要，包括75%乙醇也用DEPC水配置和最好溶解RNA的無酶水。

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8樓2012-05-02 11:05:25

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建議你把提的RNA 測(cè)下OD260/280 1.8-2.0 就可以放心做逆轉(zhuǎn)錄了，我之前做的植物的，足足做了十次才成功

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9樓2012-05-02 11:12:28

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9樓: Originally posted by Pushing2012 at 2012-05-02 11:12:28:
建議你把提的RNA 測(cè)下OD260/280 1.8-2.0 就可以放心做逆轉(zhuǎn)錄了，我之前做的植物的，足足做了十次才成功

這么有毅力呀，佩服。

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10樓2012-05-02 13:49:56

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