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johnny4890新蟲 (小有名氣)
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[求助]
提取RNA與做RT-PCR的問題
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最近從霉菌中提取總rna，質(zhì)量不好，反轉(zhuǎn)錄老是做不出來，而且pcr的時候經(jīng)常把水那組p出條帶來==。請大家給我點意見。先看看我的總rna電泳圖。 （第一次） （第二次）所用的protocol是網(wǎng)上下載的山寨版本。如下： RNA的提取 準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制) 操作步驟: 1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。 b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。 c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。 2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。 6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。 7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。 8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。 10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。 |
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johnny4890: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-02 21:38:16
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嗯................ 我覺得，這樣的RNA肯定是不能用的，電泳結(jié)果顯示出你的RNA降解的比較嚴(yán)重，同樣有Smear的話，基因組DNA還是有污染的，網(wǎng)上的這個Protocol我看基本的操作沒有問題，主要是TRIzol試劑你是怎么配的呢，還是買的商業(yè)化TRIzol？同樣具體應(yīng)用到你菌的RNA提取上，不知道這個Protocol是否適用............. 個人看法 若有說錯請高手指點  |
2樓2012-04-30 20:38:11
atlanticwi
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5樓2012-04-30 21:23:02
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