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XUMIN6891金蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于畢赤酵母pPICZaA載體
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| 各位蟲友你們好！我想請(qǐng)教一下有誰(shuí)用pPICZaA這個(gè)載體？另外我還想知道這個(gè)載體要是選Xho I酶切位點(diǎn)時(shí)必須加上AAAAGA這個(gè)序列是吧，這樣可以保證具有天然的N端，那如果我分析出來(lái)的我的已知的氨基酸序列用軟件分析中間存在信號(hào)肽的話，那樣是不是就不能做后期的克隆表達(dá)了，因?yàn)槌霈F(xiàn)的信號(hào)肽不是一處我的這段氨基酸序列是重復(fù)的，所以出現(xiàn)好多峰值，我對(duì)信號(hào)肽這塊不是太懂，想要請(qǐng)教一下！ |
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lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
西瓜: 金幣+2, 專家考核, Good！ 2012-05-18 18:51:46
西瓜: 金幣+2, 專家考核, Good！ 2012-05-18 18:51:46
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1、選者Xhol I的優(yōu)點(diǎn)是能保證天然的N端，缺點(diǎn)是必須把信號(hào)肽切割位點(diǎn)的序列補(bǔ)全；選擇其他酶切位點(diǎn)就N端多出氨基酸來(lái)了； 2、能不能做后續(xù)的克隆表達(dá)不好說(shuō)，別人是否表達(dá)過(guò)該序列，如表達(dá)過(guò)，你自然能做后續(xù)的克隆表達(dá)，如果沒(méi)有人做過(guò)，也不能說(shuō)不能做，除非人家驗(yàn)證過(guò)不能做。其實(shí)，試驗(yàn)嘛，先看文獻(xiàn)，沒(méi)有文獻(xiàn)佐證就自己試試。 |
4樓2012-05-18 15:58:03
lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 專家考核, 辛苦 2012-05-18 15:37:07
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小丹木木: 金幣+2, 專家考核, 辛苦 2012-05-18 15:37:07
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1、用pPICZaA這個(gè)載體做分泌表達(dá)，選Xho I酶切位點(diǎn)時(shí)不止加上AAAAGA，還要長(zhǎng)點(diǎn)，是AAAAGAGAGGCTGAAGCT，信號(hào)肽最終切割位點(diǎn)在Glu-Ala-Glu-Ala后面。 2、基因中存在的信號(hào)肽問(wèn)題，你可以用不同的軟件去分析下，一般說(shuō)來(lái)信號(hào)肽存在蛋白的N端，很少在中間的。 |
2樓2012-05-18 08:51:49
XUMIN6891
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謝謝你的回復(fù)，不過(guò)我還想問(wèn)幾個(gè)問(wèn)題，我對(duì)這個(gè)選酶切位點(diǎn)時(shí)候?qū)@個(gè)Xhol I和選其他的區(qū)別我不是很懂，我也可以不選Xhol I，比如選EcoR I或者其他多克隆位點(diǎn)，對(duì)嗎，只不過(guò)選者Xhol I的話能保證天然的N端嗎，選擇其他就不能保證了嗎？還有我的氨基酸序列是段重復(fù)序列，用軟件分析時(shí)就會(huì)在中間出現(xiàn)信號(hào)肽，都會(huì)在同樣的位置出現(xiàn)，這樣的話我還能繼續(xù)做后面的克隆表達(dá)嗎？ |
3樓2012-05-18 15:04:28
XUMIN6891
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5樓2012-05-18 22:17:07
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