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XUMIN6891

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[求助] 關(guān)于畢赤酵母pPICZaA載體

各位蟲友你們好！我想請教一下有誰用pPICZaA這個載體？另外我還想知道這個載體要是選Xho I酶切位點(diǎn)時(shí)必須加上AAAAGA這個序列是吧，這樣可以保證具有天然的N端，那如果我分析出來的我的已知的氨基酸序列用軟件分析中間存在信號肽的話，那樣是不是就不能做后期的克隆表達(dá)了，因?yàn)槌霈F(xiàn)的信號肽不是一處我的這段氨基酸序列是重復(fù)的，所以出現(xiàn)好多峰值，我對信號肽這塊不是太懂，想要請教一下！

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1樓 2012-05-17 21:48:18

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lxj341401

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 專家考核, 辛苦 2012-05-18 15:37:07

1、用pPICZaA這個載體做分泌表達(dá)，選Xho I酶切位點(diǎn)時(shí)不止加上AAAAGA，還要長點(diǎn)，是AAAAGAGAGGCTGAAGCT，信號肽最終切割位點(diǎn)在Glu-Ala-Glu-Ala后面。
2、基因中存在的信號肽問題，你可以用不同的軟件去分析下，一般說來信號肽存在蛋白的N端，很少在中間的。

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2樓2012-05-18 08:51:49

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XUMIN6891

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引用回帖:

2樓: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-18 08:51:49:
1、用pPICZaA這個載體做分泌表達(dá)，選Xho I酶切位點(diǎn)時(shí)不止加上AAAAGA，還要長點(diǎn)，是AAAAGAGAGGCTGAAGCT，信號肽最終切割位點(diǎn)在Glu-Ala-Glu-Ala后面。
2、基因中存在的信號肽問題，你可以用不同的軟件去分析下，一 ...

謝謝你的回復(fù)，不過我還想問幾個問題，我對這個選酶切位點(diǎn)時(shí)候?qū)︖@個Xhol I和選其他的區(qū)別我不是很懂，我也可以不選Xhol I，比如選EcoR I或者其他多克隆位點(diǎn)，對嗎，只不過選者Xhol I的話能保證天然的N端嗎，選擇其他就不能保證了嗎？還有我的氨基酸序列是段重復(fù)序列，用軟件分析時(shí)就會在中間出現(xiàn)信號肽，都會在同樣的位置出現(xiàn)，這樣的話我還能繼續(xù)做后面的克隆表達(dá)嗎？

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3樓2012-05-18 15:04:28

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【答案】應(yīng)助回帖

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西瓜: 金幣+2, 專家考核, Good！ 2012-05-18 18:51:46

引用回帖:

3樓: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-18 15:04:28:
謝謝你的回復(fù)，不過我還想問幾個問題，我對這個選酶切位點(diǎn)時(shí)候?qū)︖@個Xhol I和選其他的區(qū)別我不是很懂，我也可以不選Xhol I，比如選EcoR I或者其他多克隆位點(diǎn)，對嗎，只不過選者Xhol I的話能保證天然的N端嗎，選擇 ...

1、選者Xhol I的優(yōu)點(diǎn)是能保證天然的N端，缺點(diǎn)是必須把信號肽切割位點(diǎn)的序列補(bǔ)全；選擇其他酶切位點(diǎn)就N端多出氨基酸來了；
2、能不能做后續(xù)的克隆表達(dá)不好說，別人是否表達(dá)過該序列，如表達(dá)過，你自然能做后續(xù)的克隆表達(dá)，如果沒有人做過，也不能說不能做，除非人家驗(yàn)證過不能做。其實(shí)，試驗(yàn)嘛，先看文獻(xiàn)，沒有文獻(xiàn)佐證就自己試試。

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4樓2012-05-18 15:58:03

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4樓: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-18 15:58:03:
1、選者Xhol I的優(yōu)點(diǎn)是能保證天然的N端，缺點(diǎn)是必須把信號肽切割位點(diǎn)的序列補(bǔ)全；選擇其他酶切位點(diǎn)就N端多出氨基酸來了；
2、能不能做后續(xù)的克隆表達(dá)不好說，別人是否表達(dá)過該序列，如表達(dá)過，你自然能做后續(xù)的 ...

也就是說可以選擇其他酶切位點(diǎn)，但是N端就多氨基酸了，然后最后算蛋白大小的時(shí)候，不用從載體上面那個起始密碼子開始算嗎，我看好多文獻(xiàn)都直接從他插入基因那點(diǎn)算蛋白大小，這應(yīng)該如何解釋呢？

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5樓2012-05-18 22:17:07

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5樓: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-18 22:17:07:
也就是說可以選擇其他酶切位點(diǎn)，但是N端就多氨基酸了，然后最后算蛋白大小的時(shí)候，不用從載體上面那個起始密碼子開始算嗎，我看好多文獻(xiàn)都直接從他插入基因那點(diǎn)算蛋白大小，這應(yīng)該如何解釋呢？

信號肽會被切割的，所以不能從起始密碼子開始算。
要看文獻(xiàn)中用的是哪個酶切位點(diǎn)，如果離切割位點(diǎn)較近的酶切位點(diǎn)，那么直接從他插入基因那點(diǎn)算蛋白大小影響也不大，多幾個氨基酸分子量也不會增加1kD，但準(zhǔn)確分子量不是這么算的。

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6樓2012-05-19 06:46:23

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6樓: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-19 06:46:23:
信號肽會被切割的，所以不能從起始密碼子開始算。
要看文獻(xiàn)中用的是哪個酶切位點(diǎn)，如果離切割位點(diǎn)較近的酶切位點(diǎn)，那么直接從他插入基因那點(diǎn)算蛋白大小影響也不大，多幾個氨基酸分子量也不會增加1kD，但準(zhǔn)確分子 ...

非常感謝你的回復(fù)！我現(xiàn)在用兩種不同的分析軟件分析我的已知氨基酸結(jié)果出現(xiàn)有的會顯示有信號肽，有的就沒有，我用的是signalp3.0和4.0的，結(jié)果4.0版本的分析出來就沒有，3.0的就會有，這樣的話我應(yīng)該信哪個啊?你經(jīng)常使用的哪個軟件分析的�。窟€有我請教一個老師，他說我那個本身是段有活性的目標(biāo)蛋白，不用分析信號肽可以直接做表達(dá)，是這樣嗎？我不是很懂！請賜教！謝謝！

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7樓2012-05-19 11:47:04

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引用回帖:

7樓: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-19 11:47:04:
非常感謝你的回復(fù)！我現(xiàn)在用兩種不同的分析軟件分析我的已知氨基酸結(jié)果出現(xiàn)有的會顯示有信號肽，有的就沒有，我用的是signalp3.0和4.0的，結(jié)果4.0版本的分析出來就沒有，3.0的就會有，這樣的話我應(yīng)該信哪個啊?你 ...

既然是段有活性的目標(biāo)蛋白，那就直接做表達(dá)。

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8樓2012-05-19 11:59:38

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