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dajiong金蟲 (正式寫手)
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[求助]
構建克隆載體時出現(xiàn)的問題
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| 從藍白篩選過的平板上挑了三個陽性單克隆，搖菌過夜，第二天分別取菌液用PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)只有一個出來了目的片段（1000bp左右的）。還有一個有片段但是只有500bp，還有一個壓根沒有目的片段……膠什么的都沒問題，想知道是在哪一步出了問題。謝謝！ |
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hyacinth326
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dajiong3樓2012-05-24 14:00:25
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-05-24 13:53:24
dajiong: 金幣+10, ★★★很有幫助 2012-05-24 21:40:12
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dajiong: 金幣+10, ★★★很有幫助 2012-05-24 21:40:12
| 我們實驗室就一直在做這個，藍白篩選平板上不一定全部都是陽性克隆，存在很多假陽性，所以會出現(xiàn)有的有目的片段，有的有插入片段但不是目的片段，或者有的壓根就沒有片段插入，你這個情況很正常。我們的做法是先放在4℃冰箱數(shù)個小時，假陽性就可以表現(xiàn)出來，但是也不能完全避免這種情況，進一步菌落PCR還是會有沒有目的片段的現(xiàn)象。只要有一個克隆出來了就行，留一部分養(yǎng)著，另一部分拿去測序，就能確定克隆序列是否正確了。 |
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2樓2012-05-24 13:27:42
jasonwyb123
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4樓2012-05-24 15:02:12
5樓2012-05-24 16:22:20
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