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蛋白表達可不可能存在內含肽剪接
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| 最近使用大腸桿菌大量表達一種細菌的細胞色素c。但是western驗證的時候發(fā)現大小錯誤。同表達的其他細胞色素C都很正常，所以懷疑是不是有可能存在內含肽剪接�；蛘哂衅渌赡�？ |
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 分子生化實驗經驗積累 | 【分子生物】EPI帖 |
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lxj341401
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3樓2012-05-25 10:45:58
lxj341401
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數 +1
小丹木木: 金幣+2, 辛苦辛苦 2012-05-25 13:52:18
感謝參與，應助指數 +1
小丹木木: 金幣+2, 辛苦辛苦 2012-05-25 13:52:18
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內含肽剪接這種現象是有的，如NEB公司的IMPACT System，利用的就是內含肽切除標簽。 Chong S, Mersha FB, Comb DG,et al.Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element [J]. Gene. 1997 192(2):271-81. |
2樓2012-05-25 10:44:27
凌波麗
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數 +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 分析的很全面了哈 2012-05-25 13:52:51
感謝參與，應助指數 +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 分析的很全面了哈 2012-05-25 13:52:51
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蛋白質內含子剪切（protein cleavage）和剪接（protein splicing)都是有可能的，protein cleavage一般是由其他蛋白酶作用產生的，只是切不連接，protein splicing則不需要其他酶或者蛋白質作用，發(fā)生protein splicing的多肽自己就可以進行既切掉多肽序列中的一段或幾段序列(inteins)又把剩下的序列重新連接在一起，而且重新連接的片段有時還會發(fā)生重排，比如伴刀豆蛋白不僅剪切掉中間一段序列，而且其原先的N-末端和C-末端序列，即所謂的exteins，彼此相對位置會發(fā)生交換，N-末端成為了成熟蛋白質的C-末端序列，C-末端成為了成熟蛋白質的N-末端序列。這樣的protein splicing首先是有蛋白質的本身的一級和空間結構決定的。 閱讀框改變，肯定蛋白質的一級結構就完全不同了。 還有是發(fā)生了RNA editing，這時可能會有終止密碼改變或者中間的編碼改變而引起蛋白質序列改變，進而引起蛋白質的空間結構改變。 蛋白質降解也是必須考慮的一個問題，這與表達的工程細胞中的蛋白酶有關，可以考慮使用分泌表達或者共表達。 Translational Hopping，及翻譯時發(fā)生核糖體跳讀，在同一條mRNA中有些密碼子不翻譯，這樣的情比較少見�？赡芘cmRNA形成二級結構或者密碼子稀有性相關，如果是大腸桿菌，可能在營養(yǎng)極度缺乏時的應急反應也有關系。 不管什么原因，檢測起來不難，首先做個表達的蛋白質的N-末端與C--末端，降解和提前終止或者不正常起始翻譯一般都可以檢測出來，再用同種酶同樣條件下切割表達的蛋白質和正常的蛋白質標準品，然后分別走個電泳，可以比較出序列大致差異在何處，即肽譜分析。 |
4樓2012-05-25 11:21:28
mlanqiang
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5樓2012-05-25 12:21:16
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