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蛋白表達可不可能存在內(nèi)含肽剪接
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| 最近使用大腸桿菌大量表達一種細菌的細胞色素c。但是western驗證的時候發(fā)現(xiàn)大小錯誤。同表達的其他細胞色素C都很正常，所以懷疑是不是有可能存在內(nèi)含肽剪接�；蛘哂衅渌赡�？ |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 分析的很全面了哈 2012-05-25 13:52:51
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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 分析的很全面了哈 2012-05-25 13:52:51
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蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪切（protein cleavage）和剪接（protein splicing)都是有可能的，protein cleavage一般是由其他蛋白酶作用產(chǎn)生的，只是切不連接，protein splicing則不需要其他酶或者蛋白質(zhì)作用，發(fā)生protein splicing的多肽自己就可以進行既切掉多肽序列中的一段或幾段序列(inteins)又把剩下的序列重新連接在一起，而且重新連接的片段有時還會發(fā)生重排，比如伴刀豆蛋白不僅剪切掉中間一段序列，而且其原先的N-末端和C-末端序列，即所謂的exteins，彼此相對位置會發(fā)生交換，N-末端成為了成熟蛋白質(zhì)的C-末端序列，C-末端成為了成熟蛋白質(zhì)的N-末端序列。這樣的protein splicing首先是有蛋白質(zhì)的本身的一級和空間結(jié)構(gòu)決定的。 閱讀框改變，肯定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)就完全不同了。 還有是發(fā)生了RNA editing，這時可能會有終止密碼改變或者中間的編碼改變而引起蛋白質(zhì)序列改變，進而引起蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變。 蛋白質(zhì)降解也是必須考慮的一個問題，這與表達的工程細胞中的蛋白酶有關(guān)，可以考慮使用分泌表達或者共表達。 Translational Hopping，及翻譯時發(fā)生核糖體跳讀，在同一條mRNA中有些密碼子不翻譯，這樣的情比較少見�？赡芘cmRNA形成二級結(jié)構(gòu)或者密碼子稀有性相關(guān)，如果是大腸桿菌，可能在營養(yǎng)極度缺乏時的應(yīng)急反應(yīng)也有關(guān)系。 不管什么原因，檢測起來不難，首先做個表達的蛋白質(zhì)的N-末端與C--末端，降解和提前終止或者不正常起始翻譯一般都可以檢測出來，再用同種酶同樣條件下切割表達的蛋白質(zhì)和正常的蛋白質(zhì)標準品，然后分別走個電泳，可以比較出序列大致差異在何處，即肽譜分析。 |
4樓2012-05-25 11:21:28
lxj341401
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 辛苦辛苦 2012-05-25 13:52:18
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小丹木木: 金幣+2, 辛苦辛苦 2012-05-25 13:52:18
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內(nèi)含肽剪接這種現(xiàn)象是有的，如NEB公司的IMPACT System，利用的就是內(nèi)含肽切除標簽。 Chong S, Mersha FB, Comb DG,et al.Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element [J]. Gene. 1997 192(2):271-81. |
2樓2012-05-25 10:44:27
lxj341401
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5樓2012-05-25 12:21:16
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