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基因克隆
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我設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，第一次PCR擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出來(lái)了片段，但個(gè)人感覺條帶太暗，怕回收不回來(lái)，就扔了。第二次做，同樣的體系，同樣的條件，P出來(lái)，連一條條帶都沒有。而且第一次的讓師兄看了，一點(diǎn)都不暗，說(shuō)是能回收回來(lái)的。 請(qǐng)問各位，這是什么原因呢？為什么同樣的條件，同樣的體系，就是做不出來(lái)呢。 |
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Marado
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1：第一次P出了條帶，請(qǐng)問是就目的條帶一條呢，還是有多條條帶，如果多條說(shuō)明引物的特異性不是很好，需要摸條件，如果第一次就P出了一條且是目的條帶的話，只是有點(diǎn)暗的話，可以試著加大模板量，增加PCR循環(huán)數(shù). 2：最好對(duì)模板進(jìn)行檢測(cè)，看看是否污染或者濃度是否足夠，酶，引物，buff，水之類的東西也得確保沒有污染，這些都會(huì)不經(jīng)意中影響PCR，可以一一排除. 祝樓主好運(yùn)  |
2樓2012-07-03 10:20:26
3樓2012-07-03 12:22:42
Marado
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4樓2012-07-03 13:14:49
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7樓2012-07-03 17:10:51
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我覺得樓主做個(gè)溫度梯度怎么樣，實(shí)驗(yàn)這東西本來(lái)就存在著很大的偶然性的，摸索一下條件 其次看看你的引物或體系條件有沒有出現(xiàn)問題，我想問下你用什么酶擴(kuò)的？ 還有就是你如果帶不亮的話，可以先回收，以回收的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，也可以做個(gè)嵌式PCR，這樣有可能效果會(huì)好些！ |
8樓2012-07-04 07:23:14
9樓2012-07-04 22:46:51
西交-flx
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條帶比較暗的原因，很可能是這兩個(gè)：其一，引物特異性不好，如果設(shè)計(jì)的引物特異性很好的話，一般p出來(lái)的條帶是很亮很亮的，不會(huì)覺得很暗；其二，模板濃度很低很低，這樣的話，p出來(lái)的條帶也會(huì)感覺很暗；解決方法有兩個(gè)： 其一：把模板跑個(gè)電泳看看有無(wú)污染和查看模板濃度，如果出現(xiàn)的條帶很暗，建議將模板濃縮下，再做pcr；其二，檢查完模板沒有問題的情況下，重新設(shè)計(jì)引物，將引物特異性提高，同時(shí)適當(dāng)改變反應(yīng)條件，p出來(lái)?xiàng)l帶會(huì)很亮的，pcr 反應(yīng)條件應(yīng)該用 DNATap 聚合酶。 祝實(shí)驗(yàn)順利~ |
10樓2012-07-05 09:57:35
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