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使用E.coli復(fù)制質(zhì)粒，提取質(zhì)粒產(chǎn)量很低
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| 問題如題，使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作為宿主菌復(fù)制PCR2.1 載體攜帶基因的質(zhì)粒。culture體積是10ml， 挑單菌落接種，抗性是Gentamicin，我是在菌液OD達(dá)到1.5之后才提取質(zhì)粒的。質(zhì)粒提取用的是qiagen的試劑盒，最后使用50ulEB洗脫，但是質(zhì)粒濃度很低。這是為什么了？ |
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5樓2012-07-09 10:53:22
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6樓2012-07-09 11:12:06
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你培養(yǎng)體積很大了，但OD不高，培養(yǎng)的時(shí)候蓋子不要扭太緊，以免影響溶氧。另外提質(zhì)粒時(shí)，一般4mL菌液（過(guò)夜培養(yǎng)）足夠。buffer 2孵育一定要2min左右，不要超過(guò)4min。洗脫時(shí)，將Elution buffer加入后，60度溫箱2min，15000離心。 我一般4mL菌液，洗脫體積55uL。濃度基本不低于200 ng/uL，最高時(shí)可以提到600 ng/uL。 |
7樓2012-07-10 16:33:49
西瓜
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小丹木木: 金幣+3, 西瓜斑斑又出現(xiàn)了哈，圍觀 2012-07-11 13:40:57
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OD不是太大問題，一般質(zhì)粒隨便搖都可以的。過(guò)夜的我提過(guò)，搖6個(gè)小時(shí)、10個(gè)小時(shí)的也做過(guò)，都o(jì)k。 個(gè)人認(rèn)為你的問題是culture用太多了，導(dǎo)致加溶液2時(shí)裂解不充分，所以質(zhì)粒得率低。一般用1.5mL EP管離心收集1~3次就可以了，具體看菌體有多少。10mL絕對(duì)是太多啦。 |
8樓2012-07-10 19:22:18
西瓜
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9樓2012-07-10 19:24:22
10樓2012-07-10 23:29:43
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