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20111987金蟲 (正式寫手)
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[求助]
PCR中遇到的問題
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請大家?guī)兔Ψ治鲆幌拢何姨崛NA反轉(zhuǎn)錄后，直接作為模板，用4種不同引物擴(kuò)增得到的電泳圖如下： |
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nmhsd
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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20111987: 金幣+8, ★★★很有幫助 2012-07-15 16:42:16
20111987: 金幣+8, ★★★很有幫助 2012-07-15 16:42:16
| 個人認(rèn)為普通PCR（終點法）定量模板的量是不可取的，定量的前體是梯度稀釋后可以做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。事實上，只有在苛刻的條件的，設(shè)定好擴(kuò)增循環(huán)（一般不是35循環(huán)）下，才有可能，模板的含量與PCR產(chǎn)物電泳的亮度成線性關(guān)系。如果模板中有抑制劑（如用trozol法提取RNA后直接做RT），常會出現(xiàn)模板稀釋后P出的帶反而更亮（不信你試試）。如果有條件，或有經(jīng)費到其他的開放實驗室，應(yīng)該做熒光定量PCR，但是評價你方法的好壞的依然主要是標(biāo)曲好不好。 |
9樓2012-07-14 23:30:53
dingxiuying
木蟲 (正式寫手)
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2樓2012-07-11 14:14:25
dafeizizhu
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
20111987: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-07-12 16:56:26
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極應(yīng)助 2012-07-13 16:07:02
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| 如果引物是同一的，那么擴(kuò)出來的產(chǎn)物應(yīng)該是大小片段一樣的。如果引物不是相同的，而產(chǎn)物片段大小恰巧一樣大，也應(yīng)該在同一直線上。而，你這里的電泳圖，呈有規(guī)律的波動形狀，應(yīng)該是你電泳時，有些膠沒有被緩沖液淹沒住，或者是膠不均勻，導(dǎo)致上面的緩沖液層不均勻，受電不均勻。建議你使用多一些電泳緩沖液試試。(個人見解，不正之處還請原諒) |
3樓2012-07-11 15:45:35
20111987
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4樓2012-07-12 16:54:25
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