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[求助]
有關糖代謝酶，誰做過，請幫我想想解決的辦法，急，謝謝 已有1人參與
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SPS活性測定參照Komatsu等、Lowell等、Hubbard等和陳俊偉的方法，并加以改進。在80μl 反應體系中含 50mmol/L Hepes一NaoH緩沖液 (pH7.5),15mmol/LMgcl2，1mmol/L一1EDTA,5mmol/L NaF，10mmol/L UDPG,4mmol/L F一6一P,20mmol/L G一6一P，酶提取液;300C反應 30min，然后加入60μl 5mol/LNaOH終止反應，最后沸水浴 10min，冷卻后加入1ml 0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中)400C反應20min,測定A620。對照反應體系中不含Fru 6-P和Glc 6-P。。酶活力以單位鮮果重中的酶在單位時間內催化底物生成蔗糖的μmol數表示。單位為：μmol．h-1．g-1FW(FW指果實鮮重)。 SS合成方向的活性測定參照Lowell等、Hubbard等和陳俊偉的方法，并加以改進。在60μl反應體系中含 80mmol/LHpes一NaoH緩沖液 (pH7.5),5mmol/L KCN, 5mmol/L NaF,100mmol/L 果糖，10mmol/L UDPG，酶提取液;300C應 30min，加入60 μl 5mmol/LNaoH終止反應，沸水浴 10min，冷卻后加入1ml 0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4，中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中)400C反應20min,測定A620。對照反應體系中不含果糖。酶活力以單位鮮果重中的酶液在單位時間內催化底物生成蔗糖的μmol數表示。單位為：μmol．h-1．g-1．FW(FW指果實鮮重)。 SS分解方向的活性測定參考Lowell等和陳俊偉的方法。在490μl反應體系中含80 mmol/L Mes緩沖液(pH 5．5)，(5mmol/L NaF,100mmol/L蔗糖， 5mmol/LUDP)，酶提取液;300C反應 30min，加入490μlDNS(稱6.3g 3，5一二硝基水揚酸溶解于水中，加2.1g NaOH和185g酒石酸鉀鈉后，加水(煮沸十分鐘后冷卻密封)500mL，加熱溶解后，加重蒸酚5g，無水亞硫酸鈉 5g，加熱攪拌，冷卻后定容至1000mL，貯存于棕色瓶中，放置一周之后使用)試劑終止反應，沸水浴 5min，冷卻后測定A540。對照反應體系中不含UDP. 酶活力以單位鮮果重中的酶液在單位時間內催化底物生成蔗糖的μmol數表示。單位為：μmol．h-1．g-1．FW(FW指果實鮮重)。 酸性轉化酶(AI)和中性轉化酶(NI)的測定按照Merlo和Passera(1991)的方法，略有改動。反應液總體積為l ml，包括：o．1 mol /L乙酸鈉-乙酸(pH 4．8，對酸性轉化酶)或O．1 mol /L磷酸氫二鉀,0．1 mol /L檸檬酸鈉-檸檬酸(pH 7．2，對中性轉化酶)，0．1 mol /L蔗糖和O．1 ml酶液。在370C保溫40 min后，加1 ml 3，5-二硝基水楊酸試劑終止反應，準確煮沸5 min，冷卻，測定A520，即測定從蔗糖釋放還原糖的量。用酶空白作對照，底物空白用參比。酶空白只含有酶液和反應液，不含底物：底物空白只含有底物和反應液，不含酶液，其它步驟相同。 這是我的方法，但是我做出來不對。 1; 我用上面的蒽酮比色法做蔗糖的標曲，加入我配好的0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4，中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中）之后，蔗糖溶液全部產生乳白色的絮狀物，不知道到底是什么原因 2, 我用dns法做葡萄糖標曲時，葡萄糖濃度為500微克每毫升開始煮沸后后冷卻就產生絮狀物，加熱又會溶解，完全在書上坐標曲的濃度范圍之內，不知道這是咋咋回事 3， 我測酶活性時空白里不加每，只加底物和反應液，應該沒問題吧，但是測出來的數據還是有問題，請指點 非常感謝 |
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2樓2012-07-12 09:36:28
3樓2012-07-16 13:55:22
4樓2012-07-19 17:11:54
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