zhang8826857

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[交流] 熒光定量PCR用10ul反應(yīng)成嗎？

熒光定量PCR有人用過(guò)10ul反應(yīng)嗎？會(huì)不會(huì)太少了呀，我擔(dān)心蒸發(fā)干了，有人用過(guò)10ul反應(yīng)嗎？多謝了。手機(jī)沒(méi)法懸賞金幣，電腦上的時(shí)候追加懸賞金幣。

另外，這是我今天剛做的10ul體系的結(jié)果，不行啊，不知道是體系的問(wèn)題還是試劑的問(wèn)題呀

我的cDNA和酶都只凍融過(guò)一次，在4℃融化之后用的，在冰上配制的混合液，在冰上加的樣。大俠幫忙分析是哪兒的原因��！

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[ Last edited by zhang8826857 on 2012-7-19 at 15:20 ]

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1樓 2012-07-17 23:36:04

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hxsm

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曾經(jīng)大規(guī)模數(shù)據(jù)都是用10的，沒(méi)有一點(diǎn)問(wèn)題，但是有時(shí)候也要看儀器和你的耗材，我整個(gè)流程幾乎都是進(jìn)口耗材，包括RNA的很多都是進(jìn)口耗材，速度很快，這樣的我5的體系也用過(guò)，其實(shí)沒(méi)有什么問(wèn)題的。。。移液槍，我是采用了一套全新的移液槍，用于整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程。。。

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14樓2012-07-19 08:56:03

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應(yīng)該問(wèn)題不大

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2樓2012-07-18 08:37:42

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joan198108

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zhang8826857: 金幣+5, 謝謝 2012-09-21 16:25:02

做過(guò)15的，10的沒(méi)做過(guò)，感覺(jué)太少了吧，會(huì)不會(huì)加樣誤差大啊

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3樓2012-07-18 17:03:36

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starseacow

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沒(méi)問(wèn)題，我以前做過(guò)。要用把好一點(diǎn)的移液槍，保證加樣準(zhǔn)確。

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4樓2012-07-18 17:28:47

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Rick001

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太少了應(yīng)該會(huì)影響復(fù)孔之間的差距以及重現(xiàn)性。

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5樓2012-07-18 18:33:12

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zhang8826857: 金幣+5, 謝謝 2012-09-21 16:25:26

你的PCR管子和儀器只要配套，就沒(méi)問(wèn)題，我做過(guò)！

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6樓2012-07-18 19:34:53

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tupac225

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我覺(jué)得pcr的體系最好還是20ul的體系最好，誤差較小，你這么做事為了節(jié)約試劑嗎？沒(méi)有必要的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最重要。

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9樓2012-07-18 22:07:43

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有點(diǎn)少了，一般20以上

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10樓2012-07-18 22:38:07

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我們室用的12.5ul反應(yīng)體積。10ul體系+2.5模板，與25ul（20+5）比對(duì)過(guò)，沒(méi)問(wèn)題

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12樓2012-07-19 00:20:31

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我做的是15的，沒(méi)問(wèn)題。
實(shí)驗(yàn)室也有人做10的，保證加樣準(zhǔn)確就沒(méi)問(wèn)題。

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13樓2012-07-19 08:28:21

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做過(guò)對(duì)比，木有問(wèn)題～

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15樓2012-07-19 13:32:12

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應(yīng)該還好，別太少了吧

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16樓2012-07-19 14:44:35

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我們做的熒光PCR都是20以上的，做過(guò)25、30、40、50,但是沒(méi)做過(guò)10的體系，25的體系跑完后還可以測(cè)序的。

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18樓2012-07-19 15:37:29

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我們這邊都是用10uL的。我最早用20uL，后來(lái)看旁邊幾家課題組都是10uL，也換成10uL的了。耗材方面，我們的是AB的機(jī)器沒(méi)辦法只能用原廠耗材，其他實(shí)驗(yàn)室都用Axygen的耗材。

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19樓2012-07-19 15:46:56

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我常用的體系是這樣的（Takara的試劑盒）：

SYBR Premix Ex Taq (2X)       5 μL
Primer 1 (2 μM)                      1 μL
Primer 2 (2 μM)                      1 μL
cDNA (相當(dāng)于50 ng RNA）    1 μL
水                                           2 μL
---------------------------------------------------------
Total                                     10 μL

我們普通PCR時(shí)引物是10 μM的，為了使體積不至于太小，做定量PCR的引物我就用2 μM的了。cDNA的用量可根據(jù)需要再調(diào)整。
另外，ROX是事先加入整管SYBR Premix Ex Taq里面的，體積很小就忽略了。

[ Last edited by 西瓜 on 2012-7-19 at 16:07 ]

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20樓2012-07-19 16:03:19

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