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[交流] 相對(duì)定量?jī)?nèi)參基因的Ct值

1，請(qǐng)教各位，我最近在做熒光定量，一直在糾結(jié)一個(gè)問(wèn)題。就是要不要調(diào)整mRNA的初始濃度，讓最終熒光定量結(jié)果的內(nèi)參基因Actin的Ct值在各個(gè)組織中相差不大（貌似最好小于1個(gè)循環(huán)）？理論上應(yīng)該是各個(gè)組織中Actin的Ct值時(shí)相似的吧。
2，小弟都已經(jīng)做完了，當(dāng)時(shí)沒(méi)考慮這個(gè)問(wèn)題，做出來(lái)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Actin的Ct值在各個(gè)組織中差異挺大的，最大都到5個(gè)循環(huán)左右了。現(xiàn)在才又考慮到這個(gè)問(wèn)題了。糾結(jié)死了。這樣的結(jié)果可能會(huì)有一定的影響，但還能用不？
請(qǐng)各位不吝賜教！

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1樓 2012-07-27 12:50:23

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vickie20

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lixilei1314: 金幣+2, 好的，謝謝。 2012-07-30 09:00:40

有的人說(shuō)，RNA最好調(diào)一致再做定量，有的說(shuō)反正做的是相對(duì)定量不需要調(diào)，這個(gè)……我也在糾結(jié)中。不過(guò)我老師讓我把RNA調(diào)一致了再做。還有一個(gè)說(shuō)法是，單個(gè)內(nèi)參在各組織各時(shí)期并不是總是很穩(wěn)定，所以要用兩個(gè)內(nèi)參……

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2樓2012-07-28 10:43:35

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09丁于飛

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lixilei1314: 金幣+2 2012-08-21 17:06:02

如果是在國(guó)內(nèi)發(fā)表文章，一般用一個(gè)內(nèi)參就可以，內(nèi)參在各個(gè)組有差異不會(huì)有什么影響。但是，若要在國(guó)外期刊發(fā)表需要做兩個(gè)內(nèi)參，并且這兩個(gè)內(nèi)參得到的最終結(jié)果不能差距太大。

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3樓2012-07-28 16:27:08

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decloud

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2樓: Originally posted by vickie20 at 2012-07-27 14:43:35
有的人說(shuō)，RNA最好調(diào)一致再做定量，有的說(shuō)反正做的是相對(duì)定量不需要調(diào)，這個(gè)……我也在糾結(jié)中。不過(guò)我老師讓我把RNA調(diào)一致了再做。還有一個(gè)說(shuō)法是，單個(gè)內(nèi)參在各組織各時(shí)期并不是總是很穩(wěn)定，所以要用兩個(gè)內(nèi)參……

RNA怎么調(diào)一致啊，，我都是用nano測(cè)得濃度，然后用0.5ug逆轉(zhuǎn)錄，結(jié)果很悲催的，PCR內(nèi)參ct差3，，，，

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4樓2012-07-30 13:37:11

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vickie20

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4樓: Originally posted by decloud at 2012-07-30 13:37:11
RNA怎么調(diào)一致啊，，我都是用nano測(cè)得濃度，然后用0.5ug逆轉(zhuǎn)錄，結(jié)果很悲催的，PCR內(nèi)參ct差3，，，，...

我先測(cè)下濃度，然后再跑膠調(diào)亮度，測(cè)OD我感覺(jué)不靠譜，還是跑膠比較靠譜

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5樓2012-07-30 15:21:02

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ice-bamboo

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請(qǐng)問(wèn)樓主最后是怎么解決這個(gè)問(wèn)題的啊，多謝啦

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6樓2015-06-26 20:33:40

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ice-bamboo

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請(qǐng)問(wèn)大俠是怎么解決內(nèi)參不一致的問(wèn)題的啊

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7樓2015-06-26 20:35:08

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空談?wù)`國(guó)

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2樓: Originally posted by vickie20 at 2012-07-28 10:43:35
有的人說(shuō)，RNA最好調(diào)一致再做定量，有的說(shuō)反正做的是相對(duì)定量不需要調(diào)，這個(gè)……我也在糾結(jié)中。不過(guò)我老師讓我把RNA調(diào)一致了再做。還有一個(gè)說(shuō)法是，單個(gè)內(nèi)參在各組織各時(shí)期并不是總是很穩(wěn)定，所以要用兩個(gè)內(nèi)參……

請(qǐng)問(wèn)你是怎么調(diào)一致的？比如，反轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA都用1ug，之后rt-pcr用的CDNA都用0.1ul這就是調(diào)一致了嗎？

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8樓2015-08-10 10:18:25

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宮保雞丁YZ

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不知道你是做什么物種的，我覺(jué)得你得找?guī)灼馕奈墨I(xiàn)，看看人家做的哪個(gè)內(nèi)參在各個(gè)組織器官里表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。不一定非要用Actin作為內(nèi)參。另外，熒光定量PCR的話，我們都是在提好總RNA后，調(diào)整RNA的濃度一致，然后逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,稀釋到合理倍數(shù)后進(jìn)行qPCR的。

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9樓2015-08-10 10:49:07

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