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[交流] 質(zhì)粒提取有白色沉淀，跑膠卻沒(méi)條帶，啥原因？

質(zhì)粒提取有白色沉淀，干燥后幾乎透明，加30微升的滅菌水溶的，5微升跑膠，卻是白板，啥原因？

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1樓 2012-07-30 11:14:46

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)積極交流經(jīng)驗(yàn) 2012-08-08 14:24:06

其實(shí)出現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題有可能是非常簡(jiǎn)單的小細(xì)節(jié)，實(shí)驗(yàn)室之前出現(xiàn)這種情況（本人的樣品之前確定是正常的，同樣重新提取別人帶跑樣品是就是沒(méi)東西。后來(lái)自己重新爬一次電泳正常。）原因很簡(jiǎn)單：DNA沉淀未充分溶解。這雖然說(shuō)是比較低級(jí)的錯(cuò)誤，但是在使用真空干燥比較容易出現(xiàn)。樓主在使用真空干燥好最好不要過(guò)分干燥，在沉淀?yè)]發(fā)完乙醇之后還保持潮濕就溶解較好。（溶解得教好，DNA也不易被破壞）。建議室溫放置一段時(shí)間，以揮發(fā)干乙醇為宜。

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13樓2012-08-07 23:52:10

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質(zhì)粒提取里面有干燥滅菌水溶的步驟嗎？

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2樓2012-07-30 11:21:20

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gelois

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你提的質(zhì)粒是很大的那種嗎？當(dāng)初我提Bacmid的時(shí)候出現(xiàn)過(guò)這樣的情況。你異丙醇沉淀之后用70%的乙醇洗了么？

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3樓2012-07-30 11:31:08

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chenguestc

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樓主可以把你的操作步驟發(fā)上來(lái)才好分析，跑膠沒(méi)有帶只能說(shuō)明沒(méi)提出質(zhì)粒來(lái)。

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4樓2012-07-30 12:07:54

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3樓: Originally posted by gelois at 2012-07-30 11:31:08
你提的質(zhì)粒是很大的那種嗎？當(dāng)初我提Bacmid的時(shí)候出現(xiàn)過(guò)這樣的情況。你異丙醇沉淀之后用70%的乙醇洗了么？

2倍無(wú)水乙醇沉淀，70%的乙醇洗了

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5樓2012-07-30 12:08:10

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amisking: 回帖置頂 2012-07-30 20:12:23

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4樓: Originally posted by chenguestc at 2012-07-30 12:07:54
樓主可以把你的操作步驟發(fā)上來(lái)才好分析，跑膠沒(méi)有帶只能說(shuō)明沒(méi)提出質(zhì)粒來(lái)。

2、取培養(yǎng)好的菌液1.5ml至EP管中，10,000r/min離心60s,棄上清;
3、加入100μl預(yù)冷的Solution I，劇烈震蕩混勻；
4、加入200μl新配置的SolutionII,輕柔滾動(dòng)EP管直至管中菌體溶液呈透明，冰水浴3~5min;
5、加入150μl預(yù)冷的SolutionIII,輕柔顛倒混勻，冰水浴5~10min，12,000r/min 離心15min,棄沉淀，將上清移入另一新EP管中；
6、加入等體積氯仿，輕柔顛倒混勻，10,000r/min 離心15min,取上清液體于另一新EP管中；
7、加入0.1V的醋酸鈉，2V的無(wú)水乙醇，反復(fù)顛倒混勻，于-80℃沉淀20~30min，12,000r/min 離心15min;
8、棄上清，將EP管倒扣吸水紙上，直至EP管中液體流盡；
9、將沉淀放置在真空冷凍干燥機(jī)中干燥3~5min;
10、加入20~30μl ddH2O。

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6樓2012-07-30 12:10:46

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我們一般用試劑盒提的，很好用的

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7樓2012-07-30 13:26:07

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我用的步驟只最后一步不同，是0。1×TE溶解，不過(guò)應(yīng)該也沒(méi)大問(wèn)題，另外，不知道你用的是什么膠？我用的是0.7%瓊脂糖，220v跑了一下午，才跑出一小塊距離，你確定你的膠沒(méi)問(wèn)題？濃度、電壓、時(shí)間？

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8樓2012-07-30 15:43:58

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樓主真空干燥前有白色沉淀嗎？
哪一步沒(méi)看到白色沉淀
測(cè)一下 260/280nm OD

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9樓2012-07-30 16:25:20

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引用回帖:

6樓: Originally posted by uuu555000 at 2012-07-30 12:10:46
2、取培養(yǎng)好的菌液1.5ml至EP管中，10,000r/min離心60s,棄上清;
3、加入100μl預(yù)冷的Solution I，劇烈震蕩混勻；
4、加入200μl新配置的SolutionII,輕柔滾動(dòng)EP管直至管中菌體溶液呈透明，冰水浴3~5min;
5、加入1 ...

從操作上看沒(méi)有問(wèn)題。在培養(yǎng)菌液之前有檢測(cè)嘛？就是鑒定你的克隆是包含你的質(zhì)粒的。如果有，就只有再重提一遍看。

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10樓2012-07-30 20:20:26

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換試劑盒吧，這樣比啥都方便，估計(jì)是試劑盒或者樣品的問(wèn)題

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11樓2012-07-30 23:02:47

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sxxuan

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會(huì)不會(huì)只是蛋白污染呢？

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12樓2012-07-31 12:40:32

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根本就沒(méi)有質(zhì)粒，透明的物質(zhì)可能是蛋白吧

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14樓2012-08-08 17:20:25

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樓主，你提的是什么菌？質(zhì)粒大概多大？拷貝數(shù)多少？
我也遇到這種情況~那個(gè)透明的很難溶，應(yīng)該不是或不全是DNA~

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15樓2012-10-31 11:30:11

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10樓: Originally posted by chenguestc at 2012-07-30 20:20:26
從操作上看沒(méi)有問(wèn)題。在培養(yǎng)菌液之前有檢測(cè)嘛？就是鑒定你的克隆是包含你的質(zhì)粒的。如果有，就只有再重提一遍看。...

請(qǐng)問(wèn)如何對(duì)菌液進(jìn)行檢測(cè)？

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16樓2012-11-23 11:32:05

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16樓: Originally posted by lv4xx at 2012-11-23 11:32:05
請(qǐng)問(wèn)如何對(duì)菌液進(jìn)行檢測(cè)？...

轉(zhuǎn)化后，涂板，挑單克隆小量培養(yǎng)，培養(yǎng)后,取1UL 作模板用你的特異引物和通用引物同時(shí)做菌落PCR檢測(cè)。

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17樓2012-11-26 08:20:48

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你可能干燥時(shí)間長(zhǎng)了，DNA沒(méi)有溶解出來(lái)。

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18樓2012-11-26 11:44:43

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我也做過(guò)也出現(xiàn)可能質(zhì)粒沒(méi)提出來(lái)，配置菌液濃度低了！

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19樓2013-11-19 09:38:39

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我一般用tris-酚：氯仿：異戊醇=25：24:1除蛋白的。3次重復(fù)，效果很好，最后沉淀是透明的，用TE溶解可能會(huì)好點(diǎn)。

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20樓2013-11-19 23:11:46

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估計(jì)是試劑盒或者樣品的問(wèn)題

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21樓2014-01-29 22:25:32

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我們實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒提取的一大坨白色沉淀是RNA，老板讓要求我們必須加RNase （0.1%）37度消化1小時(shí)后，異丙醇沉淀純化后才能送測(cè)序。

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22樓2014-01-30 23:28:01

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有可能是70%酒精洗的時(shí)候洗掉了。問(wèn)下，制膠加EB了嗎？

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23樓2014-02-18 17:19:28

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我也遇到的是這種情況，你每個(gè)樣品都有平行嗎？

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24樓2015-10-22 20:54:57

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回復(fù)此樓

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