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載體構(gòu)建問題
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最近在構(gòu)建一個(gè)載體。載體用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位點(diǎn)是BamHI和HindIIII。連接了兩次都長了20個(gè)左右的菌落，其中一次做了陰性對(duì)照和感受態(tài)對(duì)照，結(jié)果只有轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的長了，但PCR和酶切鑒定都沒有，拿去測(cè)序中間連了未知的東西。做了兩周了，好急啊，請(qǐng)高手指點(diǎn)！ 另外也同時(shí)連了PET-TrX、GST、DsbA、His，結(jié)果是一樣的，每次轉(zhuǎn)化后都有菌落長出來，但是就是鑒定不出來我自己的目的片段，好郁悶 |
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以前做表達(dá)，為了確保編碼無突變，總是先克隆到載體上，測(cè)序確認(rèn)后再切下回收連接，效率很高。想問一下，你的PCR產(chǎn)物直接酶切，是利用引物引入酶切位點(diǎn)嗎？是否加了保護(hù)堿基？這對(duì)產(chǎn)物的酶切效率是有影響的。也可能是這方面的原因。如果沒有保護(hù)堿基，建議先克隆到載體上后，再導(dǎo)入pet28載體。祝順利！ |
6樓2012-08-03 20:49:11
tupac225
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| "其中一次做了陰性對(duì)照和感受態(tài)對(duì)照，結(jié)果只有轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的長了，但PCR和酶切鑒定都沒有",菌液pcr和酶切是必須的呀，這樣可以更好的篩選陽性克隆，我以前也做過這種情況，祝你好運(yùn)。 |
7樓2012-08-04 08:33:31
ankang0910
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| 你的目的片段是PCR擴(kuò)增出來的嗎？有沒有拖帶現(xiàn)象，帶弱不弱？我覺得很有可能是你產(chǎn)物沒有回收到，也就是你沒有把你的目的片段得到，所以你后來做的酶切、連接的都不是你的目的帶，導(dǎo)致酶切質(zhì)粒鑒定時(shí)切不出你的目的條帶。如果送測(cè)序的話，估計(jì)會(huì)測(cè)出比你目的基因多一些的堿基。順便問問，是不是酶切出的目的帶比你的680bp大些呢？僅供參考！ |
8樓2012-08-04 10:07:10
9樓2012-08-04 14:20:24
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