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celia2012銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
揪心的菌落PCR 已有2人參與
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幾天挑選了單菌落，進(jìn)行種屬鑒定，做了17個菌落PCR，成功了11個，實(shí)驗(yàn)過程是：挑菌加入50微升無菌水，99度裂解5分鐘，后冰浴五分鐘，離心10分鐘取上清液進(jìn)行PCR,退火溫度是55度，循環(huán)數(shù)35，25微升體系（加5微升模板） 后來繼續(xù)挑選進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，問題不斷，P出來的成功率低，不到一半，而且好多出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，這在第一次實(shí)驗(yàn)中沒出現(xiàn)過，后進(jìn)行測序說是有雜合、結(jié)合現(xiàn)象，測序終止，立馬心情受到影響了，做了大量的菌落PCR， 幾天全浪費(fèi)了~不知道是什么原因 1.由于我做的菌差異大，要一一摸條件好煩，有的濃度低了，有個又高了，難以控制，挑菌不知道挑多少合適 2.不知道做菌落PCR,是不是要將菌活化一下再挑，菌放在冰箱大概有20天了，菌放的時間長了是不是影響實(shí)驗(yàn) 3.退火溫度如何確定，多少適合？是否循環(huán)數(shù)過高了 4.菌落PCR是否可靠？還是直接先提DNA適合？主要是我要做200個菌，提起來麻煩，現(xiàn)在看來菌落PCR也不簡單？ 希望有經(jīng)驗(yàn)的蟲友們給點(diǎn)意見吧~萬分感謝啊~糾結(jié)萬惡的實(shí)驗(yàn)啊~  |
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celia2012
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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3樓2012-08-09 19:09:49
2樓2012-08-09 17:50:37
4樓2012-08-09 19:25:59
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+2, 鼓勵 2012-08-10 10:15:59
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+2, 鼓勵 2012-08-10 10:15:59
| 親，你的菌大體是什么菌��？菌種鑒定就是擴(kuò)16s唄，我做過，主要是放線菌和一些別的細(xì)菌。我的心得是：首先，要擴(kuò)增的菌必須是活化后剛長出來的很嫩的菌（這點(diǎn)比較重要），只需要挑取少量，加20微升無菌水，水浴煮沸10min即可做模板了。我用的是50微升體系，擴(kuò)增條件就是隨便看了一篇外文文獻(xiàn)上的擴(kuò)增條件。關(guān)于你說的拖尾現(xiàn)象，只要有目的條帶即可，因?yàn)楝F(xiàn)在的測序公司都是可以免費(fèi)膠回收測序的。 |
5樓2012-08-10 09:43:29
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