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celia2012銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
揪心的菌落PCR 已有2人參與
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幾天挑選了單菌落，進(jìn)行種屬鑒定，做了17個(gè)菌落PCR，成功了11個(gè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程是：挑菌加入50微升無(wú)菌水，99度裂解5分鐘，后冰浴五分鐘，離心10分鐘取上清液進(jìn)行PCR,退火溫度是55度，循環(huán)數(shù)35，25微升體系（加5微升模板） 后來(lái)繼續(xù)挑選進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，問(wèn)題不斷，P出來(lái)的成功率低，不到一半，而且好多出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，這在第一次實(shí)驗(yàn)中沒出現(xiàn)過(guò)，后進(jìn)行測(cè)序說(shuō)是有雜合、結(jié)合現(xiàn)象，測(cè)序終止，立馬心情受到影響了，做了大量的菌落PCR， 幾天全浪費(fèi)了~不知道是什么原因 1.由于我做的菌差異大，要一一摸條件好煩，有的濃度低了，有個(gè)又高了，難以控制，挑菌不知道挑多少合適 2.不知道做菌落PCR,是不是要將菌活化一下再挑，菌放在冰箱大概有20天了，菌放的時(shí)間長(zhǎng)了是不是影響實(shí)驗(yàn) 3.退火溫度如何確定，多少適合？是否循環(huán)數(shù)過(guò)高了 4.菌落PCR是否可靠？還是直接先提DNA適合？主要是我要做200個(gè)菌，提起來(lái)麻煩，現(xiàn)在看來(lái)菌落PCR也不簡(jiǎn)單？ 希望有經(jīng)驗(yàn)的蟲友們給點(diǎn)意見吧~萬(wàn)分感謝啊~糾結(jié)萬(wàn)惡的實(shí)驗(yàn)啊~  |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
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對(duì)于你的問(wèn)題，我僅僅結(jié)合我做菌落PCR的情況，討論一下你說(shuō)的4個(gè)問(wèn)題。 1.菌落PCR挑菌，不要總是挑一大團(tuán)你看得見心里才放心，只需要牙簽尖頭輕輕刮一下即可，多了會(huì)影響PCR結(jié)果的。 2.平板放的時(shí)間越長(zhǎng)，菌落PCR的結(jié)果越不準(zhǔn)確，建議還是盡快做菌落PCR驗(yàn)證。但并不是說(shuō)時(shí)間久就難P出來(lái)，而是結(jié)果不準(zhǔn)確。因?yàn)?度菌是可以生長(zhǎng)的。當(dāng)然，我覺得沒有活化的必要。本來(lái)時(shí)間就久，如果還活化，容易造成交叉污染。 3.退火溫度最好是選擇陽(yáng)性對(duì)照做一個(gè)梯度PCR確定。如果你是通用引物，一般55度是沒有問(wèn)題的。當(dāng)然你也可以根據(jù)公式算，算出來(lái)減小5到10度就可以了。 4.菌落PCR是可靠的，但是一般要結(jié)合其它的方法一起證明。你決定菌落PCR是因?yàn)槟愕钠桨宸旁?度，菌還在生長(zhǎng)，特別是多次挑菌之后容易造成交叉污染。所以一般你的平板出來(lái)后，盡快做菌落PCR是沒有問(wèn)題的。在得到陽(yáng)性結(jié)果后就馬上劃線到一個(gè)新的平板，保藏菌種。以免交叉污染影響后續(xù)試驗(yàn)，更讓你懷疑菌落PCR的準(zhǔn)確性。 簡(jiǎn)單交流，僅供參考。 |
11樓2012-08-10 16:05:29
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8樓2012-08-10 14:09:06
【答案】應(yīng)助回帖
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celia2012: 金幣+3 2012-08-09 19:09:59
zhang8826857: 金幣+5, 鼓勵(lì)新蟲，正解 2012-08-10 10:15:47
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
celia2012: 金幣+3 2012-08-09 19:09:59
zhang8826857: 金幣+5, 鼓勵(lì)新蟲，正解 2012-08-10 10:15:47
| 我做過(guò)PCR,是先提取DNA，我做PCR是為了測(cè)序，鑒定菌株的。退火溫度你可以查查，我記得是有公式的，根據(jù)DNA片段大小，可以算出退貨溫度的范圍，然后你做個(gè)梯度PCR就能得到最適溫度了。PCR的關(guān)鍵是退火溫度，循環(huán)次數(shù)不太重要吧。 |
2樓2012-08-09 17:50:37
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4樓2012-08-09 19:25:59
【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857: 金幣+2, 鼓勵(lì) 2012-08-10 10:15:59
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zhang8826857: 金幣+2, 鼓勵(lì) 2012-08-10 10:15:59
| 親，你的菌大體是什么菌啊？菌種鑒定就是擴(kuò)16s唄，我做過(guò)，主要是放線菌和一些別的細(xì)菌。我的心得是：首先，要擴(kuò)增的菌必須是活化后剛長(zhǎng)出來(lái)的很嫩的菌（這點(diǎn)比較重要），只需要挑取少量，加20微升無(wú)菌水，水浴煮沸10min即可做模板了。我用的是50微升體系，擴(kuò)增條件就是隨便看了一篇外文文獻(xiàn)上的擴(kuò)增條件。關(guān)于你說(shuō)的拖尾現(xiàn)象，只要有目的條帶即可，因?yàn)楝F(xiàn)在的測(cè)序公司都是可以免費(fèi)膠回收測(cè)序的。 |
5樓2012-08-10 09:43:29
6樓2012-08-10 09:53:33
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9樓2012-08-10 14:14:11
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10樓2012-08-10 15:08:10
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