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celia2012銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
揪心的菌落PCR 已有2人參與
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幾天挑選了單菌落，進(jìn)行種屬鑒定，做了17個(gè)菌落PCR，成功了11個(gè)，實(shí)驗(yàn)過程是：挑菌加入50微升無菌水，99度裂解5分鐘，后冰浴五分鐘，離心10分鐘取上清液進(jìn)行PCR,退火溫度是55度，循環(huán)數(shù)35，25微升體系（加5微升模板） 后來繼續(xù)挑選進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，問題不斷，P出來的成功率低，不到一半，而且好多出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，這在第一次實(shí)驗(yàn)中沒出現(xiàn)過，后進(jìn)行測序說是有雜合、結(jié)合現(xiàn)象，測序終止，立馬心情受到影響了，做了大量的菌落PCR， 幾天全浪費(fèi)了~不知道是什么原因 1.由于我做的菌差異大，要一一摸條件好煩，有的濃度低了，有個(gè)又高了，難以控制，挑菌不知道挑多少合適 2.不知道做菌落PCR,是不是要將菌活化一下再挑，菌放在冰箱大概有20天了，菌放的時(shí)間長了是不是影響實(shí)驗(yàn) 3.退火溫度如何確定，多少適合？是否循環(huán)數(shù)過高了 4.菌落PCR是否可靠？還是直接先提DNA適合？主要是我要做200個(gè)菌，提起來麻煩，現(xiàn)在看來菌落PCR也不簡單？ 希望有經(jīng)驗(yàn)的蟲友們給點(diǎn)意見吧~萬分感謝啊~糾結(jié)萬惡的實(shí)驗(yàn)啊~  |
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