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[求助]
求助！大腸桿菌轉(zhuǎn)化不長(zhǎng)菌落~
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我做的是空載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，然后挑單菌落提取質(zhì)粒。 現(xiàn)在已經(jīng)做了三次，但是都沒有出結(jié)果~ 材料如下： 空載體是5微升質(zhì)粒干粉加進(jìn)40微升Eluent（Eluent是Takala公司質(zhì)粒提取試劑盒中的）稀釋，初始濃度為160.5ng/μl，然后分別稀釋10倍（測(cè)試后濃度為15.0ng/μl）和100倍（7.0ng/μl，應(yīng)該是濃度太低，測(cè)得不精確）。 感受態(tài)是Takala的DH5α 具體步驟如下： 1。分別取以上三種各1μl加入到50μl感受態(tài)中，冰浴30min，用槍頭輕輕混勻。 2。在42℃中放置45s。 3。放入冰浴中2min。 4。在操作臺(tái)中加入500μlLB培養(yǎng)基無抗體。 5。在30攝氏度培養(yǎng)箱中200轉(zhuǎn)1h。 6。5000rpm/min中離心1min。 7。在無菌操作臺(tái)中取出上清液450μl，然后剩余的100μl全部涂板（Amp抗性），倒置到37℃培養(yǎng)箱中。 結(jié)果：不漲菌落。。 問題： 是不是濃度太大的問題，還是操作步驟有問題，求各位指導(dǎo) [ Last edited by 1949stone on 2012-8-24 at 17:05 ] |
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nongdaylf: 金幣+15 2012-08-22 20:13:30
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幾點(diǎn)意見： 1，質(zhì)粒就用初始濃度的就好了，1μl足夠了。不能用槍吹打，用手指輕彈小離心管外壁就行了，混勻之后放置半小時(shí)。 2，應(yīng)該放37度搖床，220rpm差不多，1.5小時(shí)。 3，沒必要離心，就直接取100μl涂板就行了。有時(shí)候太濃密了，會(huì)看不到明顯菌落，會(huì)像沒長(zhǎng)一樣。 4，涂板一定要等玻璃棒冷卻，不然會(huì)燙死菌的。 5，在培養(yǎng)箱中先正放半小時(shí)，再倒置，而且平板要提前半小時(shí)預(yù)熱。 |
6樓2012-08-21 13:20:45
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個(gè)人認(rèn)為你可以修改幾個(gè)條件 1.適當(dāng)增加點(diǎn)質(zhì)粒的量，但不要超過總體的十分之一就好； 2.DH5a感受態(tài)熱擊90s試試； 3.復(fù)蘇培養(yǎng)的時(shí)候培養(yǎng)基改成SOC會(huì)好很多； 4.這時(shí)候的菌很脆弱，最好把轉(zhuǎn)速降低點(diǎn)，之前有過同學(xué)只是放在恒溫培養(yǎng)箱里靜置就可以的； 5.離心時(shí)間可以增長(zhǎng)點(diǎn)，比如5min； 6.涂板的時(shí)候只要涂布均勻即可，不需要太長(zhǎng)時(shí)間； 7.涂布之后，最好正面朝上靜置幾分鐘，新平板就時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)，舊平板就時(shí)間短點(diǎn)。 個(gè)人意見，僅供參考！ |
2樓2012-08-21 11:54:04
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我覺得你轉(zhuǎn)化之后，培養(yǎng)的溫度，轉(zhuǎn)速和時(shí)間都可以修改一下，可以調(diào)成37℃，250rpm培養(yǎng)2.5h，培養(yǎng)之后只需要進(jìn)行短暫離心，不需要離心那么久， 你涂好的平板最好是平放半小時(shí)使菌液充分吸收后在倒置培養(yǎng)， 42℃應(yīng)激的時(shí)間為90s。 也有可能你操作不當(dāng)，轉(zhuǎn)化效率極低造成 |
3樓2012-08-21 12:05:21
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1、加入質(zhì)粒的時(shí)候，感受態(tài)應(yīng)該是處于冰水混合的狀態(tài)時(shí)是最好的，不要等它全融化了再加； 2、質(zhì)粒1微升的加入量有點(diǎn)少，可以適當(dāng)多加點(diǎn)，3-4微升； 3、42度熱激90s后，立即冰浴； 4、大腸桿菌搖床是在37度，轉(zhuǎn)速190rpm 1h就可以了； 5、注意或許也有感受態(tài)的問題； 6、加入的AMP的濃度是否正確； 7、涂布的時(shí)候把液體涂干，不要有水；或者涂布完后打開蓋子一點(diǎn)，讓風(fēng)吹干，之后再37度倒置培養(yǎng)。 |
4樓2012-08-21 12:43:21
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