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王艷xinwei

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 轉(zhuǎn)化后菌落pcr有目的條帶，小搖長(zhǎng)菌，再大搖不長(zhǎng)了，求幫助~

各位蟲(chóng)友，我最近做了兩批農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，挑單菌落小搖后做菌液PCR，有目的條帶，接著就開(kāi)始大搖，大概20-30ml加2-3菌液，做了六瓶，一點(diǎn)都沒(méi)長(zhǎng)，沒(méi)找到原因，接著我又挑了一次菌落，又小搖渾濁，做了菌液PCR，有目的條帶，再繼續(xù)大搖，還是一點(diǎn)都沒(méi)長(zhǎng)，很是讓我悲傷，不知道問(wèn)題出現(xiàn)在哪地方了。。。。。。我每次的培養(yǎng)基都是YEB，且加的抗生素都一致，不過(guò)我小搖后的菌是放在四度冰箱做完菌液PCR后大搖的，這有影響嗎？找不到原因了，是感受態(tài)做的不好嗎，還是其他的原因。。。。。。求幫助

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堅(jiān)持就是勝利

1樓 2012-08-25 13:27:12

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chenguestc

木蟲(chóng) (職業(yè)作家)

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王艷xinwei: 金幣+3 2012-09-13 12:49:09

20-30ml加2-3（ul? ml?）。
個(gè)人覺(jué)得，你的做法有點(diǎn)問(wèn)題。挑取單菌落后（可以用1.5ml離心管），用例如10ul水溶解稀釋，取1ul作為模板做菌落PCR，剩余的9ul加入培養(yǎng)基及抗生素在PCR過(guò)程時(shí)就開(kāi)始37度搖菌，等你的PCR完成后跑膠檢測(cè)時(shí)，你的菌液濃度也差不多了。根據(jù)PCR結(jié)果選擇需要擴(kuò)大培養(yǎng)的菌，把這1管（可能你加LB是1ml開(kāi)始）全部加到20ml培養(yǎng)基里，這樣就容易獲得你需要的了，而且時(shí)間也不會(huì)搖的太久。
你的做法是挑取后放在4度冰箱，這樣，菌幾乎不長(zhǎng)，如果你又加了LB培養(yǎng)基（具體不知道你加了多少），如果你加的是1ML, 那么如果你只是吸取其中的一部分?jǐn)U大培養(yǎng)，很有可能就沒(méi)吸到或者量太少，因?yàn)槟阕铋_(kāi)始的菌是溶解在這1ML培養(yǎng)基里的，或者你的菌還在培養(yǎng)基底部如果你開(kāi)始加了LB后沒(méi)有混勻的話。

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3樓2012-08-25 14:57:08

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lidonghong

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這種問(wèn)題我以前遇到過(guò)，大搖時(shí)菌液加的太少了，你可以加個(gè)幾百ul試試

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生物化學(xué)與分子生物學(xué)

5樓2012-08-27 10:22:31

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irenescbg

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-28 13:53:04

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，有的時(shí)候會(huì)有污染，我想問(wèn)一下你的小體積菌液的濃度是否正常，味道是否正常。另外，做PCR的時(shí)候沒(méi)有必要把菌液放4度啊，繼續(xù)搖就好了。前面有個(gè)人說(shuō)得很對(duì)，多加點(diǎn)菌液會(huì)好的。我一般都是1:100稀釋，搖大體積都沒(méi)問(wèn)題的。

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請(qǐng)賜予我正能量吧！加油！

6樓2012-08-27 16:09:47

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tanglian8655

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王艷xinwei: 金幣+3 2012-09-13 12:49:45

會(huì)不會(huì)是假陽(yáng)性啊，我們一般要要兩次在酶切才算檢測(cè)成功了。有時(shí)候第一次能長(zhǎng)菌，PCR結(jié)果也不錯(cuò)，但是再次搖菌就沒(méi)有東西了，我們判斷為假陽(yáng)性

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8樓2012-08-28 13:20:18

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peitaokong

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一般小搖后，用甘油和菌種以1:1的比例混勻，保存后置于-80度冰箱里。在-4度的冰箱幾個(gè)小時(shí)還行，時(shí)間長(zhǎng)了，會(huì)影響菌種的活性的。

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9樓2012-08-29 08:01:27

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應(yīng)該問(wèn)題出在保存菌種時(shí)的方法欠妥。你如果小搖后，立即大搖，如果仍舊搖不起來(lái)，則可能是其他的問(wèn)題。如果立即大搖能搖起來(lái)，就是你的保存菌種的方法欠妥。

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10樓2012-08-29 08:05:44

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gjs713

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接種量太少。。這個(gè)問(wèn)題我?guī)煹苡龅竭^(guò)，那會(huì)剛開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)，50ml培養(yǎng)基接10ul種子，恁是一點(diǎn)沒(méi)長(zhǎng)。~~

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勤奮、執(zhí)著、專注，則無(wú)堅(jiān)不破。

12樓2012-08-29 17:13:41

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王艷xinwei: 金幣+3 2012-09-13 12:50:43

你按1%或者更大的接種量試試看。

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勤奮、執(zhí)著、專注，則無(wú)堅(jiān)不破。

13樓2012-08-29 17:14:12

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我做的事大腸桿菌轉(zhuǎn)化后可以檢測(cè)出目的條帶可是大瑤的時(shí)候總是搖不起來(lái) 求高手支招

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14樓2013-05-08 09:55:25

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普通回帖

zhoucb

2樓2012-08-25 14:11:43

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3樓: Originally posted by chenguestc at 2012-08-25 14:57:08
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謝謝，估計(jì)有可能是放4度影響了菌的生長(zhǎng)

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4樓2012-08-26 20:55:53

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6樓: Originally posted by irenescbg at 2012-08-27 16:09:47
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，有的時(shí)候會(huì)有污染，我想問(wèn)一下你的小體積菌液的濃度是否正常，味道是否正常。另外，做PCR的時(shí)候沒(méi)有必要把菌液放4度啊，繼續(xù)搖就好了。前面有個(gè)人說(shuō)得很對(duì)，多加點(diǎn)菌液會(huì)好的。我一般都是1:100稀釋，搖 ...

謝謝
應(yīng)該沒(méi)有污染，我都有做重復(fù)，而且每個(gè)小搖都長(zhǎng)起來(lái)了，量應(yīng)該不少了，最后我將我小搖的將近5ml都加入了30ml液體培養(yǎng)基了，還是沒(méi)搖起來(lái)，難道是菌活力不夠？

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7樓2012-08-28 11:21:27

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