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王艷xinwei銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
轉(zhuǎn)化后菌落pcr有目的條帶，小搖長(zhǎng)菌，再大搖不長(zhǎng)了，求幫助~
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| 各位蟲(chóng)友，我最近做了兩批農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，挑單菌落小搖后做菌液PCR，有目的條帶，接著就開(kāi)始大搖，大概20-30ml加2-3菌液，做了六瓶，一點(diǎn)都沒(méi)長(zhǎng)，沒(méi)找到原因，接著我又挑了一次菌落，又小搖渾濁，做了菌液PCR，有目的條帶，再繼續(xù)大搖，還是一點(diǎn)都沒(méi)長(zhǎng)，很是讓我悲傷，不知道問(wèn)題出現(xiàn)在哪地方了。。。。。。我每次的培養(yǎng)基都是YEB，且加的抗生素都一致，不過(guò)我小搖后的菌是放在四度冰箱做完菌液PCR后大搖的，這有影響嗎？找不到原因了，是感受態(tài)做的不好嗎，還是其他的原因。。。。。。求幫助 |
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6樓2012-08-27 16:09:47
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【答案】應(yīng)助回帖
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王艷xinwei: 金幣+3 2012-09-13 12:49:09
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20-30ml加2-3（ul? ml?）。 個(gè)人覺(jué)得，你的做法有點(diǎn)問(wèn)題。挑取單菌落后（可以用1.5ml離心管），用例如10ul水溶解稀釋，取1ul作為模板做菌落PCR，剩余的9ul加入培養(yǎng)基及抗生素在PCR過(guò)程時(shí)就開(kāi)始37度搖菌，等你的PCR完成后跑膠檢測(cè)時(shí)，你的菌液濃度也差不多了。根據(jù)PCR結(jié)果選擇需要擴(kuò)大培養(yǎng)的菌，把這1管（可能你加LB是1ml開(kāi)始）全部加到20ml培養(yǎng)基里，這樣就容易獲得你需要的了，而且時(shí)間也不會(huì)搖的太久。 你的做法是挑取后放在4度冰箱，這樣，菌幾乎不長(zhǎng)，如果你又加了LB培養(yǎng)基（具體不知道你加了多少），如果你加的是1ML, 那么如果你只是吸取其中的一部分?jǐn)U大培養(yǎng)，很有可能就沒(méi)吸到或者量太少，因?yàn)槟阕铋_(kāi)始的菌是溶解在這1ML培養(yǎng)基里的，或者你的菌還在培養(yǎng)基底部如果你開(kāi)始加了LB后沒(méi)有混勻的話。 |
3樓2012-08-25 14:57:08
王艷xinwei
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5樓2012-08-27 10:22:31
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