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[求助] PCR條件摸索

各位大俠。。。幫我看一下吧，從左到右分別是56度，58度，60度，61、62、63度，然后使陰性，MARKER。。。我的目的基因長(zhǎng)度是1436bp。模板我用GADPH驗(yàn)證過(guò)的，所以這次Ｐ的時(shí)候就沒(méi)有Ｐ內(nèi)參。我想說(shuō)的是既然我的陰性對(duì)照沒(méi)有東西，說(shuō)明我的引物沒(méi)有引物二聚體，現(xiàn)在我想是不是應(yīng)該改變一下PCR條件呢？幫忙分析一下吧。。。3Q so much。。。我想知道原因是什么呢？
我的PCR條件是94度 5min，94度40s，55-65度30s，72度3min，72度10min 總共35個(gè)循環(huán)。。。

zlf(9-13).jpg

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【求助/交流】PCR出現(xiàn)SMEAR 已經(jīng)有9人回復(fù)
PCR退火溫度已經(jīng)有14人回復(fù)

keepon

1樓 2012-09-13 15:31:47

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gwd0312

木蟲(chóng) (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

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從你的圖看，貌似是你的退火溫度有點(diǎn)高了，問(wèn)什么不調(diào)低一點(diǎn)試一下呢？

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持之以恒、永不放棄！

2樓2012-09-13 16:39:56

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zhlf1989513

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閣下為什么說(shuō)溫度有點(diǎn)高了呢？我覺(jué)得特異性不好的話應(yīng)該是溫度低了呢。。。我還想把溫度調(diào)高試一下呢。。嘿嘿。。。不懂。。。還請(qǐng)賜教。。。

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keepon

3樓2012-09-13 18:03:13

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無(wú)疆@行者

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引物特異性差，而且根據(jù)梯度PCR看，高溫引物特異性沒(méi)有增加，反而影響了引物與模板的結(jié)合，造成產(chǎn)物減少，最好還是重新設(shè)計(jì)下引物，另外1.5KB 延伸3分鐘太長(zhǎng)了吧

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4樓2012-09-13 18:40:54

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zhlf1989513

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引用回帖:

4樓: Originally posted by 無(wú)疆@行者 at 2012-09-13 18:40:54
引物特異性差，而且根據(jù)梯度PCR看，高溫引物特異性沒(méi)有增加，反而影響了引物與模板的結(jié)合，造成產(chǎn)物減少，最好還是重新設(shè)計(jì)下引物，另外1.5KB 延伸3分鐘太長(zhǎng)了吧

寫錯(cuò)了延伸2min。我這個(gè)引物有兩篇文獻(xiàn)是報(bào)道過(guò)的用的就是這個(gè)引物來(lái)P的所以我想應(yīng)該沒(méi)什么問(wèn)題噻。。。

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keepon

5樓2012-09-13 22:18:19

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無(wú)疆@行者

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

5樓: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-09-13 22:18:19
寫錯(cuò)了延伸2min。我這個(gè)引物有兩篇文獻(xiàn)是報(bào)道過(guò)的用的就是這個(gè)引物來(lái)P的所以我想應(yīng)該沒(méi)什么問(wèn)題噻。。。...

如果說(shuō)引物沒(méi)有問(wèn)題的話，會(huì)不會(huì)你的模板出現(xiàn)問(wèn)題了，不知道你的模板怎么來(lái)的，會(huì)不會(huì)純度不夠，參雜著其他東西，另外你的PCR產(chǎn)物和Marker是點(diǎn)的同樣的量嗎，35個(gè)cycle你的PCR產(chǎn)物量太低了，一是有非特異性擴(kuò)增，而是你的模板量少

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6樓2012-09-13 23:09:29

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6樓: Originally posted by 無(wú)疆@行者 at 2012-09-13 23:09:29
如果說(shuō)引物沒(méi)有問(wèn)題的話，會(huì)不會(huì)你的模板出現(xiàn)問(wèn)題了，不知道你的模板怎么來(lái)的，會(huì)不會(huì)純度不夠，參雜著其他東西，另外你的PCR產(chǎn)物和Marker是點(diǎn)的同樣的量嗎，35個(gè)cycle你的PCR產(chǎn)物量太低了，一是有非特異性擴(kuò)增，而 ...

PCR產(chǎn)物和Marker是點(diǎn)的同樣的量啊。。。這個(gè)有關(guān)系嗎？一般我們都是35個(gè)循環(huán)啊。。。我只是想想知道怎樣提高我的目的基因的條帶？

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keepon

7樓2012-09-14 08:41:25

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wu_shiyong

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照LZ說(shuō)的基本上都沒(méi)有問(wèn)題
看圖顯然后面的退火溫度較高，55度可以試一下，而且可以換下好點(diǎn)的酶試試！

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低調(diào)穩(wěn)重務(wù)實(shí)內(nèi)斂---------------殘

8樓2012-09-14 08:56:33

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8樓: Originally posted by wu_shiyong at 2012-09-14 08:56:33
照LZ說(shuō)的基本上都沒(méi)有問(wèn)題
看圖顯然后面的退火溫度較高，55度可以試一下，而且可以換下好點(diǎn)的酶試試！

恩今天我正在降低溫度P一下。。不行也準(zhǔn)備換個(gè)酶。。。哎。。。糾結(jié)死了。。。

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keepon

9樓2012-09-14 11:10:57

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dingxiuying

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★ ★
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-14 16:28:03

1、marker條帶也不清楚，這證明你的膠也做的不是太好。
2、再降低退火溫度。首先不要管特異性的問(wèn)題，你至少要能找到可以擴(kuò)出目的片段的退火溫度，然后在那個(gè)溫度附近再調(diào)整退火溫度，以解決特異性的問(wèn)題。不過(guò)這些的前提是你的電泳結(jié)果要清晰。

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我喜歡默默地被你注視默默地注視著你，我喜歡深深地被你愛(ài)著深深地愛(ài)著你

10樓2012-09-14 11:46:39

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