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Marado金蟲 (正式寫手)
Dreamer
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[求助]
求助！關于GST融合蛋白純化！樓主愁得一夜沒有睡好！
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目前的情況是這樣的： 1.構建的表達載體測序正確 2.37℃誘導有目的條帶，表達量不錯. 3.上清無目的蛋白，無酶活，這個與文獻相符. 4.細胞破碎后，上清有目的蛋白，但是遠不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感覺破碎怎么都不澄清，可能包涵體含量較高？ 5.破碎后的細胞上清測量有酶活，且酶活力還不錯. 6.目前用菌液量為1L，37℃誘導6h的細胞去破碎，之后測量酶活，發(fā)現(xiàn)只有上次破碎250ml細胞，單位酶活的1/3，可能是沒有破碎完全？后取上清進行純化，純化后悲劇了……發(fā)現(xiàn)純化后無酶活，目前正在進行SDS-PAGE，看流川液，洗滌液，洗脫液中是否有目的蛋白，  樓主這個表達做了幾個月了，好容易到了最后一步純化了，昨晚12點測完酶活，心都是涼的……一宿沒睡好.想請大家?guī)兔Ψ治鲆幌�，可能哪里出問題了. |
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GST標簽的蛋白一般掛柱效果都比較差。而且你是在37度誘導的，細菌生長最為迅速，產(chǎn)生蛋白也很快，所以蛋白的折疊會比較匆忙，很有可能你的蛋白沒有正確折疊，把GST標簽裹在里面了，所以才會不掛柱的。 所以介意你采取低溫過夜誘導，盡量讓蛋白正確緩慢的折疊，這樣會對你的掛柱有所改善。 還有次級選擇就是用尿素變性，這樣GST標簽就露在外面，就肯定能夠掛柱了，不過變性復性的就會很麻煩，損失較大，活性也不見得會好。 |
Marado4樓2012-09-19 10:24:35
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3樓2012-09-19 10:12:47
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首先我覺得你的表達沒有大的問題。如果覺得包涵體過多，可以考慮降低溫度，30°或者16°，同時降低IPTG的濃度，。在高水平表達時,新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白折疊的速率就會導致包涵體的形成。因此,降低重組蛋白合成的速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達。 再有你的蛋白的酶活性，兩次的破碎后未純化的結果不同，這一步可能是超聲的原因，因為兩次的量不同，不知道你是怎么處理的？有些人認為超聲功率過大會導致部分肽鍵斷裂，不過沒有被證實；總之，超聲的條件是很重要的。 最后純化的話：選擇低鹽濃度洗脫，一般蛋白純化后都要除鹽，在這你的蛋白雖然表達出來了，但是不代表就一定正確的折疊，這樣就和包涵體一樣，沒有活性，你就得考慮變性再復性了，但是一般的結果不會太好。 你不是有文獻嗎？測酶活的時候照著文獻來就是了。 最后，大腸表達系統(tǒng)的缺點就是可能表達的外源蛋白是沒有活性的，因為大腸桿菌不會對目標蛋白進行正確修飾。而芽孢桿菌表達系統(tǒng)就克服了這個缺點，但是芽孢桿菌不好轉化。 希望對你有用。 |
5樓2012-09-19 10:25:02
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