 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3183 | 回復(fù): 20 | |||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 MolEPI ，點擊這里進行查看 | |||
Marado金蟲 (正式寫手)
Dreamer
|
[求助]
求助！關(guān)于GST融合蛋白純化！樓主愁得一夜沒有睡好！
|
||
|
目前的情況是這樣的： 1.構(gòu)建的表達載體測序正確 2.37℃誘導(dǎo)有目的條帶，表達量不錯. 3.上清無目的蛋白，無酶活，這個與文獻相符. 4.細胞破碎后，上清有目的蛋白，但是遠不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感覺破碎怎么都不澄清，可能包涵體含量較高？ 5.破碎后的細胞上清測量有酶活，且酶活力還不錯. 6.目前用菌液量為1L，37℃誘導(dǎo)6h的細胞去破碎，之后測量酶活，發(fā)現(xiàn)只有上次破碎250ml細胞，單位酶活的1/3，可能是沒有破碎完全？后取上清進行純化，純化后悲劇了……發(fā)現(xiàn)純化后無酶活，目前正在進行SDS-PAGE，看流川液，洗滌液，洗脫液中是否有目的蛋白，  樓主這個表達做了幾個月了，好容易到了最后一步純化了，昨晚12點測完酶活，心都是涼的……一宿沒睡好.想請大家?guī)兔Ψ治鲆幌�，可能哪里出問題了. |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有135人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 關(guān)于E-tag標記蛋白的純化問題！~求助，謝謝幫忙~！
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 帶GST標簽的融合蛋白的純化問題——急急急
已經(jīng)有4人回復(fù)
- GST柱純化蛋白 是否變性
已經(jīng)有6人回復(fù)
- gst標簽蛋白的表達和純化
已經(jīng)有17人回復(fù)
- GST融合蛋白表達純化
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 蛋白互作必會，GST純化遇到的問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- gst標簽，蛋白純化
已經(jīng)有25人回復(fù)
- GST融合蛋白純化求助 �。�！
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 【求助/交流】蛋白質(zhì)純化的疑難問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】帶GST標簽的重組蛋白的純化？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】蛋白純化
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 【求助/交流】原核表達蛋白純化
已經(jīng)有29人回復(fù)
tupac225
金蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應(yīng)助: 103 (高中生)
- 金幣: 1967.9
- 散金: 20
- 紅花: 4
- 帖子: 460
- 在線: 175.3小時
- 蟲號: 1533370
- 注冊: 2011-12-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Marado: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-09-19 10:40:28
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵應(yīng)助 2012-09-19 15:05:42
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Marado: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-09-19 10:40:28
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵應(yīng)助 2012-09-19 15:05:42
|
首先我覺得你的表達沒有大的問題。如果覺得包涵體過多，可以考慮降低溫度，30°或者16°，同時降低IPTG的濃度，。在高水平表達時,新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白折疊的速率就會導(dǎo)致包涵體的形成。因此,降低重組蛋白合成的速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達。 再有你的蛋白的酶活性，兩次的破碎后未純化的結(jié)果不同，這一步可能是超聲的原因，因為兩次的量不同，不知道你是怎么處理的？有些人認為超聲功率過大會導(dǎo)致部分肽鍵斷裂，不過沒有被證實；總之，超聲的條件是很重要的。 最后純化的話：選擇低鹽濃度洗脫，一般蛋白純化后都要除鹽，在這你的蛋白雖然表達出來了，但是不代表就一定正確的折疊，這樣就和包涵體一樣，沒有活性，你就得考慮變性再復(fù)性了，但是一般的結(jié)果不會太好。 你不是有文獻嗎？測酶活的時候照著文獻來就是了。 最后，大腸表達系統(tǒng)的缺點就是可能表達的外源蛋白是沒有活性的，因為大腸桿菌不會對目標蛋白進行正確修飾。而芽孢桿菌表達系統(tǒng)就克服了這個缺點，但是芽孢桿菌不好轉(zhuǎn)化。 希望對你有用。 |
5樓2012-09-19 10:25:02
yubin0815
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 1232.7
- 帖子: 128
- 在線: 258.8小時
- 蟲號: 197910
- 注冊: 2006-02-25
- 性別: GG
- 專業(yè): 病毒學(xué)
Marado2樓2012-09-19 10:06:47
Marado
金蟲 (正式寫手)
Dreamer
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 81 (初中生)
- 金幣: 1458.8
- 散金: 100
- 紅花: 1
- 帖子: 430
- 在線: 196.7小時
- 蟲號: 1512351
- 注冊: 2011-11-27
- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2012-09-19 10:12:47
gelois
金蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 59 (初中生)
- 金幣: 6015.3
- 紅花: 2
- 帖子: 375
- 在線: 149.6小時
- 蟲號: 1655503
- 注冊: 2012-03-01
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Marado: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-09-19 10:40:37
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-19 15:06:05
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Marado: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-09-19 10:40:37
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-19 15:06:05
|
GST標簽的蛋白一般掛柱效果都比較差。而且你是在37度誘導(dǎo)的，細菌生長最為迅速，產(chǎn)生蛋白也很快，所以蛋白的折疊會比較匆忙，很有可能你的蛋白沒有正確折疊，把GST標簽裹在里面了，所以才會不掛柱的。 所以介意你采取低溫過夜誘導(dǎo)，盡量讓蛋白正確緩慢的折疊，這樣會對你的掛柱有所改善。 還有次級選擇就是用尿素變性，這樣GST標簽就露在外面，就肯定能夠掛柱了，不過變性復(fù)性的就會很麻煩，損失較大，活性也不見得會好。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4樓2012-09-19 10:24:35
Marado
金蟲 (正式寫手)
Dreamer
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 81 (初中生)
- 金幣: 1458.8
- 散金: 100
- 紅花: 1
- 帖子: 430
- 在線: 196.7小時
- 蟲號: 1512351
- 注冊: 2011-11-27
- 專業(yè): 生物化學(xué)
6樓2012-09-19 10:39:34
Marado
金蟲 (正式寫手)
Dreamer
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 81 (初中生)
- 金幣: 1458.8
- 散金: 100
- 紅花: 1
- 帖子: 430
- 在線: 196.7小時
- 蟲號: 1512351
- 注冊: 2011-11-27
- 專業(yè): 生物化學(xué)
7樓2012-09-19 10:40:14
Marado
金蟲 (正式寫手)
Dreamer
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 81 (初中生)
- 金幣: 1458.8
- 散金: 100
- 紅花: 1
- 帖子: 430
- 在線: 196.7小時
- 蟲號: 1512351
- 注冊: 2011-11-27
- 專業(yè): 生物化學(xué)
8樓2012-09-19 10:41:53
zhaoxiaoming
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 3262.5
- 散金: 2743
- 紅花: 4
- 帖子: 1997
- 在線: 128.5小時
- 蟲號: 1947699
- 注冊: 2012-08-20
- 性別: GG
- 專業(yè): 昆蟲學(xué)
9樓2012-09-19 11:07:23
tupac225
金蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應(yīng)助: 103 (高中生)
- 金幣: 1967.9
- 散金: 20
- 紅花: 4
- 帖子: 460
- 在線: 175.3小時
- 蟲號: 1533370
- 注冊: 2011-12-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
10樓2012-09-19 11:08:04
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 Marado 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +5 | 崔wj 2026-03-26 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 316求調(diào)劑 +7 | 江辭666 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
[考研] 食品工程專碩一志愿中海洋309求調(diào)劑 +4 | 小張zxy張 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工方向336分 +8 | 辰沐5211314 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 希望上岸阿小楊 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)/290求調(diào)劑/本科經(jīng)歷豐富/工科也可 +9 | 丹青奶蓋 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 330一志愿中國海洋大學(xué) 化學(xué)工程 085602 有讀博意愿 求調(diào)劑 +3 | wywy.. 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 266分求材料化工冶金礦業(yè)等專業(yè)的調(diào)劑 +4 | 哇呼哼呼哼 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 315調(diào)劑 +4 | 0860求調(diào)劑 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉大071010，316分求調(diào)劑 +3 | xgbiknn 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
材料學(xué)碩，求調(diào)劑
 6+5
|
糖葫蘆888ll 2026-03-22 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +8 | hanamiko 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京郵電大學(xué) 288分 材料考研 求調(diào)劑 +3 | jl0720 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境專碩324分求調(diào)劑推薦 +5 | 軒小寧—— 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工328分調(diào)劑 +6 | 。，。，。，。i 2026-03-23 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 290分調(diào)劑求助 +3 | 吉祥止止陳 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0854AI CV方向招收調(diào)劑 +4 | 章小魚567 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] B區(qū)考研調(diào)劑 +4 | yqdszhdap－ 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 300分，材料，求調(diào)劑，英一數(shù)二 +5 | 超贊的 2026-03-24 | 5/250 |
|