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Marado金蟲 (正式寫手)
Dreamer
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[求助]
求助！關(guān)于GST融合蛋白純化！樓主愁得一夜沒有睡好！
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目前的情況是這樣的： 1.構(gòu)建的表達載體測序正確 2.37℃誘導(dǎo)有目的條帶，表達量不錯. 3.上清無目的蛋白，無酶活，這個與文獻相符. 4.細胞破碎后，上清有目的蛋白，但是遠不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感覺破碎怎么都不澄清，可能包涵體含量較高？ 5.破碎后的細胞上清測量有酶活，且酶活力還不錯. 6.目前用菌液量為1L，37℃誘導(dǎo)6h的細胞去破碎，之后測量酶活，發(fā)現(xiàn)只有上次破碎250ml細胞，單位酶活的1/3，可能是沒有破碎完全？后取上清進行純化，純化后悲劇了……發(fā)現(xiàn)純化后無酶活，目前正在進行SDS-PAGE，看流川液，洗滌液，洗脫液中是否有目的蛋白，  樓主這個表達做了幾個月了，好容易到了最后一步純化了，昨晚12點測完酶活，心都是涼的……一宿沒睡好.想請大家?guī)兔Ψ治鲆幌�，可能哪里出問題了. |
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 【分子生物】EPI帖 |
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Marado2樓2012-09-19 10:06:47
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GST標簽的蛋白一般掛柱效果都比較差。而且你是在37度誘導(dǎo)的，細菌生長最為迅速，產(chǎn)生蛋白也很快，所以蛋白的折疊會比較匆忙，很有可能你的蛋白沒有正確折疊，把GST標簽裹在里面了，所以才會不掛柱的。 所以介意你采取低溫過夜誘導(dǎo)，盡量讓蛋白正確緩慢的折疊，這樣會對你的掛柱有所改善。 還有次級選擇就是用尿素變性，這樣GST標簽就露在外面，就肯定能夠掛柱了，不過變性復(fù)性的就會很麻煩，損失較大，活性也不見得會好。 |
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4樓2012-09-19 10:24:35
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