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Marado金蟲 (正式寫手)
Dreamer
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[求助]
求助！關(guān)于GST融合蛋白純化！樓主愁得一夜沒有睡好！
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目前的情況是這樣的： 1.構(gòu)建的表達(dá)載體測(cè)序正確 2.37℃誘導(dǎo)有目的條帶，表達(dá)量不錯(cuò). 3.上清無(wú)目的蛋白，無(wú)酶活，這個(gè)與文獻(xiàn)相符. 4.細(xì)胞破碎后，上清有目的蛋白，但是遠(yuǎn)不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感覺破碎怎么都不澄清，可能包涵體含量較高？ 5.破碎后的細(xì)胞上清測(cè)量有酶活，且酶活力還不錯(cuò). 6.目前用菌液量為1L，37℃誘導(dǎo)6h的細(xì)胞去破碎，之后測(cè)量酶活，發(fā)現(xiàn)只有上次破碎250ml細(xì)胞，單位酶活的1/3，可能是沒有破碎完全？后取上清進(jìn)行純化，純化后悲劇了……發(fā)現(xiàn)純化后無(wú)酶活，目前正在進(jìn)行SDS-PAGE，看流川液，洗滌液，洗脫液中是否有目的蛋白，  樓主這個(gè)表達(dá)做了幾個(gè)月了，好容易到了最后一步純化了，昨晚12點(diǎn)測(cè)完酶活，心都是涼的……一宿沒睡好.想請(qǐng)大家?guī)兔Ψ治鲆幌�，可能哪里出�?wèn)題了. |
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 【分子生物】EPI帖 |
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tupac225
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首先我覺得你的表達(dá)沒有大的問(wèn)題。如果覺得包涵體過(guò)多，可以考慮降低溫度，30°或者16°，同時(shí)降低IPTG的濃度，。在高水平表達(dá)時(shí),新生肽鏈的聚集速率一旦超過(guò)蛋白折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成。因此,降低重組蛋白合成的速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達(dá)。 再有你的蛋白的酶活性，兩次的破碎后未純化的結(jié)果不同，這一步可能是超聲的原因，因?yàn)閮纱蔚牧坎煌�，不知道你是怎么處理的？有些人認(rèn)為超聲功率過(guò)大會(huì)導(dǎo)致部分肽鍵斷裂，不過(guò)沒有被證實(shí)；總之，超聲的條件是很重要的。 最后純化的話：選擇低鹽濃度洗脫，一般蛋白純化后都要除鹽，在這你的蛋白雖然表達(dá)出來(lái)了，但是不代表就一定正確的折疊，這樣就和包涵體一樣，沒有活性，你就得考慮變性再?gòu)?fù)性了，但是一般的結(jié)果不會(huì)太好。 你不是有文獻(xiàn)嗎？測(cè)酶活的時(shí)候照著文獻(xiàn)來(lái)就是了。 最后，大腸表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)就是可能表達(dá)的外源蛋白是沒有活性的，因?yàn)榇竽c桿菌不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行正確修飾。而芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)就克服了這個(gè)缺點(diǎn)，但是芽孢桿菌不好轉(zhuǎn)化。 希望對(duì)你有用。 |
5樓2012-09-19 10:25:02
yubin0815
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不知道你電泳的結(jié)果怎么樣了 先是看有沒有純化到目的蛋白，再就是看看純化體系是否影響酶活 大量誘導(dǎo)的單位表達(dá)量與預(yù)表達(dá)相比下降是正常的 可以優(yōu)化條件或者擴(kuò)大體積 總之 沒必要太傷心 有表達(dá)有活性都是好事 說(shuō)明已經(jīng)成功了大半了 另外，洗脫體積大不大？純化后是否進(jìn)行了濃縮？ |
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Marado2樓2012-09-19 10:06:47
Marado
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3樓2012-09-19 10:12:47
gelois
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GST標(biāo)簽的蛋白一般掛柱效果都比較差。而且你是在37度誘導(dǎo)的，細(xì)菌生長(zhǎng)最為迅速，產(chǎn)生蛋白也很快，所以蛋白的折疊會(huì)比較匆忙，很有可能你的蛋白沒有正確折疊，把GST標(biāo)簽裹在里面了，所以才會(huì)不掛柱的。 所以介意你采取低溫過(guò)夜誘導(dǎo)，盡量讓蛋白正確緩慢的折疊，這樣會(huì)對(duì)你的掛柱有所改善。 還有次級(jí)選擇就是用尿素變性，這樣GST標(biāo)簽就露在外面，就肯定能夠掛柱了，不過(guò)變性復(fù)性的就會(huì)很麻煩，損失較大，活性也不見得會(huì)好。 |
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4樓2012-09-19 10:24:35
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