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[交流] RT-PCR引物稀釋問題，歡迎戰(zhàn)友們進來指導！急盼中

大家好，我的引物是交給英駿公司合成，之前沒進行過引物稀釋，大家?guī)兔纯次覍⑦@樣配制是否正確，我需要的引物終濃度為10umol/L。以其中一管引物為例：nmols per OD=4.4，每管為1OD，離心后，先加入10ul DEPC水稀釋成100umol/L母液，混勻，再取出100ul母液加入900ulDEPC水，混勻，即得10umol/L溶液。

另外，稀釋的溶液說法不一，有用滅菌后的超純水、TE溶液、DEPC水，是不是進行RT-PCR實驗，采用DEPC水更好一些？？

最后，英駿公司的DNA合成說明書背面，我有一些看不明白，給出這個信息
Scale of Synthesis:100nmole想說明的是什么哦？？

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1樓 2012-11-01 19:48:36

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2011加油: 金幣+2, 是的，謝謝交流，是按照后面更正的來計算不？盼回復 2012-11-01 21:42:44
2011加油: 回帖置頂 2012-11-02 14:40:07

是開始加44ul depc水形成母液的吧

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4樓2012-11-01 20:22:15

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有點錯誤了，需要更正一下，第一步先加44ul DEPC水，形成母液100umol/L。

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2樓2012-11-01 19:50:25

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再去10ul母液加入90ul DEPC水，混勻，即得。

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3樓2012-11-01 19:54:29

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2011加油: 金幣+2, 謝謝指導，能再回答一下說明書背面的100nmol是什么意思不？我確實沒看明白 2012-11-01 21:43:47
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5樓2012-11-01 20:41:36

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2011加油: 金幣+2, 謝謝交流啊 2012-11-02 08:18:32

用滅菌的二級水溶解即可

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7樓2012-11-01 21:52:00

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靜安jingan

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2011加油: 金幣+2, 呵呵，謝謝，那我明白了，每管有多少nmol，就先加入它10倍量的DEPC水變成母液。 2012-11-02 08:20:16

引用回帖:

4樓: Originally posted by 靜安jingan at 2012-11-01 20:22:15
是開始加44ul depc水形成母液的吧

是啊，我也是剛和師兄學習的嘿嘿

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8樓2012-11-01 22:18:10

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flyde1234

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2011加油: 金幣+2, 恩，好的，謝謝指導。祝實驗順利 2012-11-02 14:41:36

樓主，稀釋用水用二級水滅菌就可以了，如果沒有用純凈水滅菌也可以，我們實驗室是做過實驗的發(fā)現(xiàn)它們之間對實驗結果沒什么影響。稀釋的話你直接稀釋成10uM就可以了，不用那么麻煩。

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9樓2012-11-02 10:48:13

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小丑魚663

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2011加油: 金幣+2, 哈哈，我明白 2012-11-02 14:42:21

我也是他們家的,都跑出來了.你稀釋的根我不一樣.我分兩次稀釋,第一次按管上的標志數(shù)*10倍稀釋,之后在10倍稀釋.

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10樓2012-11-02 11:52:16

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2011加油: 金幣+1, 呵呵，是的，謝謝指出錯誤，我在下面的第二條和第三條發(fā)言中更正了。 2012-11-02 14:37:58

感覺你第一步就弄錯了,呵呵,你做參考阿,提個建議.

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11樓2012-11-02 11:54:49

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引用回帖:

11樓: Originally posted by 小丑魚663 at 2012-11-02 11:54:49
感覺你第一步就弄錯了,呵呵,你做參考阿,提個建議.

我在后面又更正了，你再幫我看看，對不？

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13樓2012-11-02 14:36:50

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mutou1025

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2011加油: 金幣+1, 哈哈，引物終濃度是多少哦？ 2012-11-02 17:37:26

做RT 引物濃度不能太高，要不溶解曲線上就會看到二聚體的曲線了。我做20ul 引物一般加0.6ul

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14樓2012-11-02 15:14:24

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caoxin1984

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稀釋引物的溶液確實好多，滅菌后的超純水、TE溶液、DEPC水均可，對后續(xù)進行RT-PCR實驗影響不大。
但有報道顯示，引物在偏酸性的溶液中易降解（超純水很多偏酸性），采用偏堿性的TE溶液對于引物的長期保存會更好一些

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15樓2012-11-02 17:17:17

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引用回帖:

15樓: Originally posted by caoxin1984 at 2012-11-02 17:17:17
稀釋引物的溶液確實好多，滅菌后的超純水、TE溶液、DEPC水均可，對后續(xù)進行RT-PCR實驗影響不大。
但有報道顯示，引物在偏酸性的溶液中易降解（超純水很多偏酸性），采用偏堿性的TE溶液對于引物的長期保存會更好一些

恩這個我也了解了一下

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16樓2012-11-02 21:24:15

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引用回帖:

5樓: Originally posted by gbone80 at 2012-11-01 20:41:36
PCR引物的儲存濃度是100umol，按合成說明書上寫明的加入DEPC水即得，然后取部分再稀釋10倍，即10umol。在最終體系里面濃度是1umol。

請問，，如果OD是2.5 nmol 12.5
125 buffer for 100 mM
如何配制呢，，，與OD有關系嗎

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17樓2013-10-25 13:31:56

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簡單回復

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2012-11-01 21:43 回復

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