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wwm2008505金蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切之后，線狀質(zhì)粒的連接問題
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| 我想把一個34bp的DNA片段和一個經(jīng)過酶切后的質(zhì)粒（已經(jīng)成線狀了），設(shè)計的時候他們有粘性末端，然后用T4連接酶4度過夜連接，載體和插入片段mol比是1:5，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板。長出來的菌落很少，挑了之后搖菌，時間長才變渾濁。再做菌液PCR沒有看到檢測的條帶。求助，是哪一步不對，或者是需要改進(jìn)的 |
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sarah-miao
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| LS很對哈，你才34bp那么小的片段不需要做連接加上的，直接把目的序列加在引物上，做PCR連上就好了，你這樣太麻煩了呢 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
wwm20085058樓2012-12-04 21:49:11
cicelyzh
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5樓2012-12-04 15:11:07
6樓2012-12-04 16:28:02
huoyongting
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【答案】應(yīng)助回帖
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wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助 2012-12-09 15:06:33
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助 2012-12-09 15:06:33
才34bp ，你直接用PCR的方法，把目的片段加在引物上，PCR擴增整個質(zhì)粒，成功率非常高的，我前幾天還做了一次，測序正確 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
7樓2012-12-04 17:13:48
9樓2012-12-07 12:49:12
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-12-07 16:31:29
wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝解答 2012-12-09 15:05:44
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-12-07 16:31:29
wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝解答 2012-12-09 15:05:44
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質(zhì)粒是單酶切還是雙酶切？ 如果是單酶切必須去磷酸化處理防止自連。 如果是雙酶切，T4這一套是否有效，別人是否用過，因為buffer里含ATP，若buffer失效也會導(dǎo)致連接失敗。 另外，也可能是PCR的問題，是否做了陽性和陰性對照。 |
2樓2012-12-04 10:52:16
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3樓2012-12-04 11:29:36
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4樓2012-12-04 13:37:40
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10樓2012-12-09 15:10:53
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