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wwm2008505金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
雙酶切之后，線狀質(zhì)粒的連接問(wèn)題
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| 我想把一個(gè)34bp的DNA片段和一個(gè)經(jīng)過(guò)酶切后的質(zhì)粒（已經(jīng)成線狀了），設(shè)計(jì)的時(shí)候他們有粘性末端，然后用T4連接酶4度過(guò)夜連接，載體和插入片段mol比是1:5，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板。長(zhǎng)出來(lái)的菌落很少，挑了之后搖菌，時(shí)間長(zhǎng)才變渾濁。再做菌液PCR沒(méi)有看到檢測(cè)的條帶。求助，是哪一步不對(duì)，或者是需要改進(jìn)的 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助 2012-12-09 15:06:33
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wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助 2012-12-09 15:06:33
才34bp ，你直接用PCR的方法，把目的片段加在引物上，PCR擴(kuò)增整個(gè)質(zhì)粒，成功率非常高的，我前幾天還做了一次，測(cè)序正確 |
wwm20085057樓2012-12-04 17:13:48
ls1988121
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-12-07 16:31:29
wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝解答 2012-12-09 15:05:44
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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wwm2008505: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝解答 2012-12-09 15:05:44
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質(zhì)粒是單酶切還是雙酶切？ 如果是單酶切必須去磷酸化處理防止自連。 如果是雙酶切，T4這一套是否有效，別人是否用過(guò)，因?yàn)閎uffer里含ATP，若buffer失效也會(huì)導(dǎo)致連接失敗。 另外，也可能是PCR的問(wèn)題，是否做了陽(yáng)性和陰性對(duì)照。 |
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2樓2012-12-04 10:52:16
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4樓2012-12-04 13:37:40
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