落淚天使

新蟲(chóng) (初入文壇)

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[求助] 體外蛋白純化

我的基因原核表達(dá)是包涵體的形式存在的，而我想做蛋白的活性，要純化蛋白，不知道該怎么辦才能使蛋白可溶呢？我的表達(dá)載體是pGEX，有人能指導(dǎo)一下嗎？

非常感謝！

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1樓 2012-12-05 17:34:15

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jiangyhai

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可以考慮試試SUMO標(biāo)簽載體。

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靜心做事。

2樓2012-12-05 20:53:31

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zx1984

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wizardfan: 金幣+1, 謝謝參與 2012-12-08 07:17:29

可以先用鹽酸胍或是尿素變性純化，然后再?gòu)?fù)性就行了。

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3樓2012-12-06 08:31:29

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xj0311

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建議調(diào)整一下溫度，誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，使其盡可能的減少包涵體

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4樓2012-12-06 13:15:21

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生物小通

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wizardfan: 金幣+1, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2012-12-08 07:17:15

可以選擇換標(biāo)簽，我們用TRX一般都有可溶的。多嘗試溫度等變化對(duì)表達(dá)的影響，最好不要用變性復(fù)性的方法，一個(gè)是難，另一個(gè)是沒(méi)有好的方法進(jìn)行全面的檢測(cè)活性恢復(fù)。

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學(xué)習(xí)，進(jìn)步

5樓2012-12-07 08:15:11

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wolfman840

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破壁了萃取不行嗎？

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6樓2012-12-07 13:15:08

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gaorongbest

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我記得我們師兄當(dāng)時(shí)是用超聲破碎來(lái)做的，你可以試試行不行，可以在冰上超聲，以免細(xì)胞活性降低，或者加一點(diǎn)蛋白酶抑制劑，都可以先試試，一般蛋白純化需要幾種方法連用，還有標(biāo)簽的選擇等很多問(wèn)題

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為客戶提供更好的科研外包服務(wù)：如分子、免疫、病理、細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等

7樓2012-12-07 15:12:50

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冼亮淀粉酶

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除了摸索表達(dá)條件外，換載體也是一種方法，同時(shí)試一下包涵體復(fù)溶。

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流星來(lái)時(shí)我許了個(gè)愿，愿我有吃有喝還有舒服的豬圈。討厭發(fā)帖前不搜索論壇重復(fù)發(fā)帖和僅把論壇當(dāng)解決問(wèn)題工具，久不看論壇一來(lái)就提問(wèn)者，寧棄EPI和VIP也不回帖。

8樓2012-12-08 01:36:00

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grape114

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1.先處理包涵體，除去一些雜質(zhì)，用去垢劑EDTA,DTT，脫氧膽酸鈉，DNase 1，溶解濕菌體，破菌，收集包涵體
2.變性。8~10M尿素變性
3.復(fù)性。比較困難2M尿素，添加一些精氨酸，Tris，EDTA 等

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笑對(duì)人生，相信自己。

9樓2012-12-14 13:05:16

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wangyoucao52

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變復(fù)性得到的活性蛋白會(huì)減少，最好是調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度，低溫誘導(dǎo)等，先少量看看是否有可溶性的產(chǎn)生，還是這樣比較省事

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10樓2012-12-14 14:27:38

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