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小屁熊8023鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
真核表達(dá)his-tag蛋白純化后沒(méi)有活性
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具體的實(shí)驗(yàn)總結(jié)： 1. 表達(dá)載體pHis1522，表達(dá)菌Bacillus Megaterium，中文叫巨大芽孢桿菌，木糖啟動(dòng)子 2. 目的蛋白A很大，300多KD，his-tag在蛋白c端 3. 成熟的protocal和paper，之前的實(shí)驗(yàn)室其他人提取出來(lái)過(guò) 4. 我表達(dá)后電泳跑出來(lái)了，但是沒(méi)有毒性 5. 表達(dá)的時(shí)候同時(shí)做了與其同源的同構(gòu)建載體的另一個(gè)蛋白B的表達(dá)，同protocal，沒(méi)有問(wèn)題，當(dāng)然，B表達(dá)量高 6. 因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室不是做蛋白的實(shí)驗(yàn)室，沒(méi)有高級(jí)的純化系統(tǒng)，用的是Merck的重力柱，手動(dòng)梯度洗脫。 現(xiàn)在很糾結(jié)的就是沒(méi)活性，木糖啟動(dòng)子是37度誘導(dǎo)，paper上說(shuō)的是12-16h誘導(dǎo)，我降溫到30度，提取沒(méi)活性，降溫到25度，不掛柱，超聲2s，停10s binding buffer 沒(méi)有咪唑的 |
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reallpf
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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先要確定問(wèn)題出在表達(dá)還是純化階段：拿陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)測(cè)純化前后樣品的活力。 如果是純化階段，建議測(cè)序檢驗(yàn)His-tag是否加在基因后面了；如果成功添加His-tag，就要從純化的方式上考慮了。 如果沒(méi)有較好的純化柱子，建議將樣品超濾脫鹽后測(cè)酶活。因?yàn)殡x子對(duì)酶活也會(huì)有影響。 如果純化前的樣品就沒(méi)有活力，那么問(wèn)題就比較復(fù)雜了。因?yàn)槟愕腟DS-PAGE結(jié)果有目的蛋白，而且是在成熟protocol和paper的基礎(chǔ)上，那么可以確定蛋白是得到表達(dá)了，而且方法沒(méi)有問(wèn)題。所以需要從你使用的宿主考慮了。我朋友的經(jīng)歷，表達(dá)一個(gè)酶，比你的結(jié)果更奇怪，總是有條帶沒(méi)酶活或者有較低酶活但是沒(méi)有條帶。 認(rèn)為需要確認(rèn)酶是否需要某些后加工，而使用的宿主無(wú)法提供；或者有酶原序列的問(wèn)題；另外可以考慮真對(duì)你的宿主優(yōu)化密碼子以及培養(yǎng)發(fā)酵條件。 個(gè)人觀點(diǎn)。 |
2樓2012-12-21 16:19:56
小屁熊8023
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2012-12-25 16:18:28
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