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關(guān)于原核表達(dá)問(wèn)題 已有4人參與
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現(xiàn)將載體構(gòu)建好了，但不知道接下來(lái)怎么做？載體是pET28a 檢測(cè)都合適了，現(xiàn)在想跑個(gè)sds–page 但不知道怎么做？ 要把檢測(cè)合適的構(gòu)建好的重組DNA挑斑搖菌，然后用IPTG誘導(dǎo)？這個(gè)誘導(dǎo)劑濃度是多少？ 然后就離心取上清跑SDS–PAGE？ 還是怎么做？ 跑出的膠怎么分析？跑膠用的marker 是多少？ 最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？ 本人是一塌糊涂 請(qǐng)大家給予多多的意見和資料 謝謝 謝謝 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-12-30 18:55:57
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amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-12-30 18:55:57
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載體構(gòu)建好了，鑒定沒問(wèn)題后，就轉(zhuǎn)化表達(dá)菌啊，pET系列的要轉(zhuǎn)化帶DE3的表達(dá)菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用來(lái)表達(dá)pET28a載體。 如果已經(jīng)轉(zhuǎn)化了表達(dá)菌。那么可以挑克隆，進(jìn)行小量誘導(dǎo)了。 具體方法就是： 1、挑克隆到試管中，比如20ml試管中裝入5mlLB培養(yǎng)基，加相應(yīng)的抗生素。過(guò)夜培養(yǎng)得到種子菌。 2、同樣20ml試管中裝5ml LB培養(yǎng)基，接入搖好的種子菌，接種量1%-5%。自己看著接就行了。 3、37℃，200-250rpm培養(yǎng) 4、OD600到0.6-0.8時(shí)，加入母液濃度為1M的IPTG，致終濃度0.1-1.0mM。第一次小誘可以加到終濃度1mM。 5、37度過(guò)夜誘導(dǎo)。16小時(shí)左右。 6、第二天取1ml菌液，離心，菌體沉淀用100ul 去離子水，或PBS或TRIS buffer重選，加loading buffer跑電泳。 7、如果確定有表達(dá)，就可以破菌鑒定可溶性了。 |
2樓2012-12-30 13:24:14
3樓2012-12-30 16:42:18
4樓2012-12-30 16:44:22
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5樓2012-12-31 03:54:38
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6樓2012-12-31 03:55:54
joan198108
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樓主首先要確定構(gòu)建的載體已經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，比如BL21，DH5a一類屬于克隆宿主，不適于表達(dá)。此外，還可以根據(jù)目的蛋白性質(zhì)選擇相應(yīng)的宿主。 確定轉(zhuǎn)入到表達(dá)宿主后，先是正常培養(yǎng)活化菌體，然后取活化菌體轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)基，待菌體OD達(dá)到一定值時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，一般終濃度為0.1-1mM，這個(gè)要自己摸索。需要摸索的還有誘導(dǎo)溫度，這個(gè)跨度也可能比較大，但是一般是低溫誘導(dǎo)，防止形成包涵體。誘導(dǎo)時(shí)間也要自己摸索，一般十幾道二十幾個(gè)小時(shí)。 一般誘導(dǎo)后，離心獲得菌體，清洗后超聲或者高壓破菌，離心后取上清上樣。Marker大小要根據(jù)自己目的蛋白大小來(lái)定，如果不知道可以選用廣范圍的蛋白marker。 最后一個(gè)問(wèn)題，根據(jù)目的蛋白序列可以用一些軟件估計(jì)其大小，網(wǎng)上不少相關(guān)的軟件，樓主可以自己找找。 祝好運(yùn)! |
7樓2012-12-31 08:59:24
8樓2012-12-31 10:18:38
9樓2012-12-31 10:18:47
10樓2012-12-31 10:20:13
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