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關(guān)于原核表達(dá)問題 已有4人參與
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現(xiàn)將載體構(gòu)建好了，但不知道接下來怎么做？載體是pET28a 檢測都合適了，現(xiàn)在想跑個(gè)sds–page 但不知道怎么做？ 要把檢測合適的構(gòu)建好的重組DNA挑斑搖菌，然后用IPTG誘導(dǎo)？這個(gè)誘導(dǎo)劑濃度是多少？ 然后就離心取上清跑SDS–PAGE？ 還是怎么做？ 跑出的膠怎么分析？跑膠用的marker 是多少？ 最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？ 本人是一塌糊涂 請大家給予多多的意見和資料 謝謝 謝謝 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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3樓2012-12-30 16:42:18
snoopyzxx
木蟲 (著名寫手)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2012-12-30 18:55:57
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amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2012-12-30 18:55:57
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載體構(gòu)建好了，鑒定沒問題后，就轉(zhuǎn)化表達(dá)菌啊，pET系列的要轉(zhuǎn)化帶DE3的表達(dá)菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用來表達(dá)pET28a載體。 如果已經(jīng)轉(zhuǎn)化了表達(dá)菌。那么可以挑克隆，進(jìn)行小量誘導(dǎo)了。 具體方法就是： 1、挑克隆到試管中，比如20ml試管中裝入5mlLB培養(yǎng)基，加相應(yīng)的抗生素。過夜培養(yǎng)得到種子菌。 2、同樣20ml試管中裝5ml LB培養(yǎng)基，接入搖好的種子菌，接種量1%-5%。自己看著接就行了。 3、37℃，200-250rpm培養(yǎng) 4、OD600到0.6-0.8時(shí)，加入母液濃度為1M的IPTG，致終濃度0.1-1.0mM。第一次小誘可以加到終濃度1mM。 5、37度過夜誘導(dǎo)。16小時(shí)左右。 6、第二天取1ml菌液，離心，菌體沉淀用100ul 去離子水，或PBS或TRIS buffer重選，加loading buffer跑電泳。 7、如果確定有表達(dá)，就可以破菌鑒定可溶性了。 |
2樓2012-12-30 13:24:14
4樓2012-12-30 16:44:22
snoopyzxx
木蟲 (著名寫手)
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5樓2012-12-31 03:54:38
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