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jasminezhao金蟲 (小有名氣)
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[求助]
DNA測(cè)序問題
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| 最近在做重組子的構(gòu)建，可是做完轉(zhuǎn)化后，提取的質(zhì)粒為什么濃度很低只有幾十ng/ui，這個(gè)是什么原因跟跳的單克隆菌落的大小有關(guān)系嗎？還有就是送去測(cè)序?yàn)槭裁吹玫降男蛄薪Y(jié)果非常少只有三四百個(gè)bp，這是什么原因？希望大家能給寶貴意見，都做了三四個(gè)月了還是無結(jié)果，真的急瘋了，謝謝各位了��！ |
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xingxingsf
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-05 17:38:24
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-05 17:38:24
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做完轉(zhuǎn)化的平板上長(zhǎng)出的菌落是很小，所以要先劃到新的平板上養(yǎng)一夜，長(zhǎng)多點(diǎn)再提質(zhì)粒，理論上即使挑很小的菌落在液體LB培養(yǎng)基里養(yǎng)一夜也能長(zhǎng)到10的9次方左右了，足夠提質(zhì)粒了。你很少的原因可能是轉(zhuǎn)化效率低，重組質(zhì)粒沒轉(zhuǎn)進(jìn)去？ 測(cè)序一個(gè)反應(yīng)就400bp左右，你的片段長(zhǎng)的話可以要求公司測(cè)通，再拼接起來就行了。 |
2樓2013-01-04 21:13:43
Haibara_Ai
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3樓2013-01-05 03:42:48
cicelyzh
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-05 17:38:36
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你用的手提質(zhì)粒還是盒子提？如果的低拷貝質(zhì)粒，盒子提就是幾十ng/ul。如果希望濃度高就多搖些菌。挑很小的克隆搖菌過夜提質(zhì)粒也足夠的。 高質(zhì)量的測(cè)序一個(gè)反應(yīng)可以讀600-700nt，但是后面的分辨率也不是很好，400nt是正常的。當(dāng)然，如果模板質(zhì)量高，測(cè)序出來的結(jié)果會(huì)更漂亮，讀出來的也稍微長(zhǎng)一點(diǎn)。但也不會(huì)超過我說的那個(gè)數(shù)目了。如果你的序列長(zhǎng)，需要多個(gè)引物測(cè)，再把序列拼接起來。 |
4樓2013-01-05 08:57:31
jasminezhao
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5樓2013-01-05 09:17:20
jasminezhao
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6樓2013-01-05 09:18:50
jasminezhao
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7樓2013-01-05 09:23:00
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8樓2013-01-05 09:45:51
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9樓2013-01-05 10:03:46
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-05 17:39:00
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-05 17:39:00
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是什么載體？不同載體的復(fù)制子不一樣，拷貝數(shù)也不同。此外，是不是抗生素失效了。如果抗生素壓力小，質(zhì)粒的拷貝數(shù)也上不去。還有，你的平板在4度放了很久嗎？時(shí)間久了菌的活力下降，提質(zhì)粒的時(shí)候濃度也上不去。至于測(cè)序的結(jié)果，1400應(yīng)該是兩個(gè)反應(yīng)，正反兩個(gè)方向的引物拼接出來的。如果是一個(gè)反應(yīng)不可能讀這么長(zhǎng)的。你可以仔細(xì)檢查，是否兩個(gè)反應(yīng)的引物都給出了序列。 |
10樓2013-01-05 12:44:38
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