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fayzhao金蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切后切膠回收
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各位蟲友好： 目前，我正在做質(zhì)粒雙酶切，體系40ul： dd水 補(bǔ)足40ul 10Xtango buffer 4ul 質(zhì)粒 2ug kpnI 2ul bglII 2ul 37℃反應(yīng)5h,電泳檢測圖如下： 目的是為了回收目的條帶（300多bp），切膠回收用了takara的和axygen的，都沒有回收到，跑膠沒有任何條帶。接下來我要做的是將目的基因連接到表達(dá)載體中，回收不到怎么辦哪？求幫助�。�！ 2013-1-20雙酶切_副本.jpg |
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2樓2013-01-23 17:55:50
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【答案】應(yīng)助回帖
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一般克隆時，設(shè)計一個連接反應(yīng)，載體需要100ng左右，根據(jù)分子數(shù)比例（外源片段是載體的3-10倍），事實(shí)上，需要的外源片段的絕對量很少（一般不超過50ng). 但考慮到回收的小片段定量的準(zhǔn)確性，一般回收到的小片段濃度需要達(dá)到10ng/ul。而且再考慮回收時體積最少20ul，而小片段的回收效率一般很難超過50%，因而，回收時小片段的理論量至少是10ng/ul X 20ul X 2 =400ng。由于你的小片段只占你的載體分子的1/10---1/15，因而，你進(jìn)行酶切時就需要載體至少4--6ug.否則，你很難回收到足夠量的小片段進(jìn)行隨后的連接。 為了保證載體的完全酶切，你可能需要利用double digestion disigner精確計算酶切所需要的酶量。 |
7樓2013-01-23 22:12:27
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