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羥脯氨酸的含量測(cè)定，急急急~
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各位蟲(chóng)友有人用紫外測(cè)出過(guò)膠原蛋白里面的羥脯氨酸的含量么？比較穩(wěn)定的么？ 我試過(guò)幾種方法，都失敗了，請(qǐng)各位幫著想想是什么原因，有什么辦法解決或者有更好的辦法可以測(cè)出羥脯氨酸的？小蟲(chóng)不勝感激。 方法一 (l)7%氯胺T水溶液，暗室保存。 (2)醋酸一檸檬酸緩沖液(PH一6.0):579醋酸鈉(CH3C00Na.3H2O)，37.59二水檸檬酸三鈉，5.59一水檸檬酸，385mL異丙醇共同溶于水，定容至IL，室溫保存。 (3)重結(jié)晶對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于57%高氯酸，配成2:3(g:mL)溶液，棕色瓶保存三周有效。 (4)氧化劑A液:7%氯胺T:醋酸一檸檬酸緩沖液(V/V)=1:4，用前配制;顯色劑B 液:對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液:異丙醇(V/V)=3:13，用前配制。精確稱取標(biāo)品輕脯氨酸30mg定容于loomL，稀釋10倍成為3omoL/L標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取omL，lmL，ZmL，3mL，4mL，5mL標(biāo)準(zhǔn)液定容至50mL，各自取定容后溶液lmL于試管中，向每只試管加入0.4mL異丙醇和0.2mLA液，攪拌3一5min，再分別向每只試管加入B液2.6mL，攪拌，60℃水浴25min，冷卻，于558nm處比色。根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 方法二 試劑的配制檸檬酸緩沖液:檸檬酸鈉120g、冰醋酸12ml、檸檬酸46g、氫氧化 鈉34g溶解于蒸餾水中，調(diào)整PH值至6.0，然后定容至1000mL。‘ 0.05mol/L氯胺T溶液:稱取氯胺T7.05g，溶解于100mL蒸餾水中，然后加入 乙二醉獨(dú)甲醚150mL，再加入250mL檸檬酸緩沖液混合均勻。 對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑A:取無(wú)水乙醇20mL，慢慢加入濃硫酸2.74ml;試劑 B:取對(duì)二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入無(wú)水乙醇40mL，水浴加熱使其完全溶解并冷卻至室溫，然后將A液慢慢加入B，混合均勻。 3.5mol/L高氯酸溶液:取27ml高氯酸，以蒸餾水定容到100mL。 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液：準(zhǔn)確稱取L羥基脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1OOmg，加入O.O1mol/L鹽酸中溶解，稀釋并定容到1OOmL.在冰箱中保存。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液1OmL到1OOmL容量瓶中，用蒸餾水定容到1OOmL(臨用前配)，濃度為1OOug/mL. 吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液I.O、2 0、2 5、3 0、3 5、40、4.5mL，分別用蒸餾水定容到1OOmL.以蒸餾水為空白，分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液1mL.加入1mL檸檬酸緩沖液和1mL 0.05mol/L氯胺T溶液，室溫(25℃)氧化1Omin后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置1Omin，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑1mL，在65℃水浴顯色1Omin．冷卻后在561nm處測(cè)吸光度。以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程 方法三 ①pH6.8的檸檬酸緩沖溶液：溶解26.0g檸檬酸C6H8O7•H2O，14.0g氫氧化鈉和78.0g醋酸鈉于500mL水中，轉(zhuǎn)移溶液到1000mL容量瓶中。加入250mL正丙醇，用水稀釋至刻度。此液于4℃在深色瓶中保存，可穩(wěn)定幾個(gè)星期； ②氯胺T試劑：溶解1.41g氯胺T于100mL如上的緩沖試劑中（現(xiàn)配現(xiàn)用）； ③對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑：稱取10.0g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶解于35.0mL高氯酸 [60%(m/m)]，緩慢加入65.0mL異丙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用）； ④羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，500μg•mL-1：準(zhǔn)確稱取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg，用少量水溶解于100mL容量瓶中，加入一滴3mol•L-1硫酸，定容至刻度。該溶液在4℃下能穩(wěn)定至少1月； ⑤羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取5mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于500mL容量瓶中，用蒸餾 水稀釋定容，質(zhì)量濃度為5μg•mL-1（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液10.0、20.0、30.0、40.0與50.0mL，分別用蒸餾水定容至100mL，此標(biāo)準(zhǔn)溶液的羥脯氨酸濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μg•mL-1 ；吸取4mL上述稀釋好的溶液于具塞試管中，加入2.00mL氯胺T，搖勻后在室溫下放置20min，加入2.00mL顯色劑，搖勻后迅速將試管移至60℃的水浴中，保溫20min，再用流動(dòng)的水冷卻試管至少3min，室溫下放置30min，最后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在558±2nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。空白溶液用蒸餾水代替，過(guò)程同上。 方法一沒(méi)有最后測(cè)的溶液是澄清的而且為黃色，測(cè)出的值也是不穩(wěn)定忽高忽低。我用的是L-羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品。 方法二 試劑B 出現(xiàn)不溶現(xiàn)象，加入的無(wú)水乙醇和對(duì)二甲基氨基苯甲醛分層，像油水分離的狀態(tài)，下層發(fā)綠，油狀，并且我的試劑是新買的。加完高氯酸后10min-20min試管會(huì)出現(xiàn)白色絮狀物，最后沉底，包括空白組。 方法三 第一步加入正丙醇就會(huì)和鹽溶液分層。正丙醇不溶鹽，將鹽析出。 |
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4樓2013-10-31 20:02:20
supervisor
金蟲(chóng) (小有名氣)
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- 金幣: 1197.7
- 帖子: 107
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- 蟲(chóng)號(hào): 1851019
2樓2013-04-25 16:49:46
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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樣品用6 M HCl在回流冷凝器中，溫度為110 ◦C下水解24 h，然后用1號(hào)試紙過(guò)濾。將濾液pH用1 M NaOH溶液調(diào)到6.0–6.5。取上述樣品0.1 mL于試管中，然后加入0.2 mL異丙醇充分混合，再加入0.1 mL氯胺 T (7 % ,w/v)和pH為6的醋酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液(1:4, v/v)，充分混合。然后加入1.3 mL歐利希試劑（2 g p-二甲基氨基苯甲醛溶解于3 mL60% (v/v)的高氯酸中和13 mL的異丙醇）。上述混合液在60 ◦C水浴中加熱25 min，然后在流動(dòng)水中冷卻2-3 min。溶液用異丙醇稀釋至5 mL。以水作參比利用紫外分光光度計(jì)在558 nm處測(cè)定吸光值。 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：濃度范圍在10 ~ 60 mg/L。羥脯氨酸含量以mg/g 樣品表示。 這是外文方法~ 我自己翻譯的哦！看看能不能幫到你！ |
5樓2013-11-12 19:40:56
6樓2014-06-26 15:41:39
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