 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2733 | 回復(fù): 4 | ||
kinglovecw銅蟲 (小有名氣)
|
[求助]
求助EGFP蛋白的western及免疫熒光問題！�。。�！急急急！�。。�！ 已有1人參與
|
|
小弟最近構(gòu)建了一個(gè)EGFP融合表達(dá)的蛋白，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以后，DAPI染色然后共聚焦觀察其在細(xì)胞內(nèi)的定位。可是發(fā)現(xiàn)熒光很快就粹滅了，根本無法拍照，用p-EFGP-N3空載體的話好一些。我的實(shí)驗(yàn)過程是：0.4%多聚甲醛固定10分鐘，0.1 triton 透膜5分鐘，DAPI染色20分鐘，期間都是PBS清洗三遍。不知道問題出在哪里！ 再就是用RIPA強(qiáng)裂解細(xì)胞提取總蛋白，用試劑盒分離核和質(zhì)蛋白后進(jìn)行western實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)總蛋白中無法檢測(cè)到EGFP，試劑盒提取的核與質(zhì)蛋白又可以，不知是否是RIPA強(qiáng)導(dǎo)致的EGFP的降解。 先謝謝各位大神了！�。。。。�！ [ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ] |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
313求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
083000學(xué)碩274求調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
環(huán)境工程 085701，267求調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
291求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
一志愿中海洋320化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)碩求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
08工科，295，接受跨專業(yè)調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
08工科求調(diào)劑286
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
學(xué)碩274求調(diào)劑
已經(jīng)有13人回復(fù)
-
一志愿085600中科院寧波所276分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
0817化工學(xué)碩調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- Western Blot電泳蛋白質(zhì)外漏問題求助
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教大分子量蛋白western blot轉(zhuǎn)膜的一些問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】極小分子與極大分子蛋白的Western Bloting轉(zhuǎn)膜求助！
已經(jīng)有10人回復(fù)
jiejiewutong
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 2991.3
- 帖子: 289
- 在線: 35.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 1297795
- 注冊(cè): 2011-05-17
- 專業(yè): 黏膜免疫學(xué)
2樓2013-03-06 17:33:27
曾文正公
金蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 4564.3
- 紅花: 6
- 帖子: 1936
- 在線: 626.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 2161228
- 注冊(cè): 2012-12-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+3, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金幣+5, ★有幫助 2013-03-09 19:54:02
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+3, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金幣+5, ★有幫助 2013-03-09 19:54:02
|
我們通常做染色是這樣的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室溫固定15min,PBS洗兩次，0.1% triton in PBS室溫打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗兩次，就可以看了，如果是玻片的話還需要封片。提醒一下，GFP在酸性環(huán)境下熒光會(huì)淬滅的。 你WB方面的問題確實(shí)很奇怪，GFP是很穩(wěn)定的，不應(yīng)該連wb都做不出來。如果你懷疑你的RIPA，那你就從小木蟲上找個(gè)RIPA配方自己配一下，RIPA這東西真覺得沒必要買，自己配的比賣的好多了。希望能幫到你，祝好 |
3樓2013-03-06 17:51:01
kinglovecw
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 587
- 散金: 40
- 紅花: 7
- 帖子: 65
- 在線: 43.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 1293719
- 注冊(cè): 2011-05-12
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)與分化
4樓2013-03-09 19:53:00
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
5樓2014-03-13 14:56:04
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 Kfrank 的主題更新
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿085600中科院寧波所276分求調(diào)劑 +6 | 材料學(xué)257求調(diào)劑 2026-03-28 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 085404 22408 315分 +3 | zhuangyan123 2026-03-31 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 277跪求調(diào)劑 +8 | 1915668 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +16 | 新時(shí)代材料 2026-03-27 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 295材料工程專碩求調(diào)劑 +10 | 1428151015 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿南開大學(xué)0710生物學(xué)359求調(diào)劑 +5 | 兔兔兔111223314 2026-03-29 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +8 | 星野? 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +7 | 陳晨79 2026-03-30 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 318一志愿吉林大學(xué)生物與醫(yī)藥 求調(diào)劑 +5 | 篤行致遠(yuǎn). 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +10 | 鈕恩雪 2026-03-25 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京理工大學(xué)本科211材料工程294求調(diào)劑 +8 | mikasa的圍巾 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +4 | 蝶舞輕繞 2026-03-29 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +6 | 崔wj 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動(dòng)285求調(diào)劑 +3 | AZMK 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑11408 +3 | 劉小鹿lu 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +11 | 陽陽哇塞 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考博] 26申博 +3 | 加油沖��！ 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉大071010，316分求調(diào)劑 +3 | xgbiknn 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 打過很多競(jìng)賽，085406控制工程300分，求調(diào)劑 +3 | askeladz 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理085500機(jī)械專業(yè)總分300求調(diào)劑 +3 | an10101 2026-03-24 | 7/350 |
|