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kinglovecw銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助EGFP蛋白的western及免疫熒光問題！！�。。〖奔奔保。。。。� 已有1人參與
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小弟最近構建了一個EGFP融合表達的蛋白，轉染293T細胞以后，DAPI染色然后共聚焦觀察其在細胞內的定位�？墒前l(fā)現(xiàn)熒光很快就粹滅了，根本無法拍照，用p-EFGP-N3空載體的話好一些。我的實驗過程是：0.4%多聚甲醛固定10分鐘，0.1 triton 透膜5分鐘，DAPI染色20分鐘，期間都是PBS清洗三遍。不知道問題出在哪里！ 再就是用RIPA強裂解細胞提取總蛋白，用試劑盒分離核和質蛋白后進行western實驗，發(fā)現(xiàn)總蛋白中無法檢測到EGFP，試劑盒提取的核與質蛋白又可以，不知是否是RIPA強導致的EGFP的降解。 先謝謝各位大神了！�。。。。�！ [ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ] |
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【答案】應助回帖
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wizardfan: 金幣+3, 謝謝分享經(jīng)驗 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金幣+5, ★有幫助 2013-03-09 19:54:02
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kinglovecw: 金幣+5, ★有幫助 2013-03-09 19:54:02
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我們通常做染色是這樣的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室溫固定15min,PBS洗兩次，0.1% triton in PBS室溫打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗兩次，就可以看了，如果是玻片的話還需要封片。提醒一下，GFP在酸性環(huán)境下熒光會淬滅的。 你WB方面的問題確實很奇怪，GFP是很穩(wěn)定的，不應該連wb都做不出來。如果你懷疑你的RIPA，那你就從小木蟲上找個RIPA配方自己配一下，RIPA這東西真覺得沒必要買，自己配的比賣的好多了。希望能幫到你，祝好 |
3樓2013-03-06 17:51:01
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5樓2014-03-13 14:56:04
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