 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2736 | 回復(fù): 4 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
kinglovecw銅蟲 (小有名氣)
|
[求助]
求助EGFP蛋白的western及免疫熒光問題�。。。�！急急急�。。。�！ 已有1人參與
|
||
|
小弟最近構(gòu)建了一個(gè)EGFP融合表達(dá)的蛋白，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以后，DAPI染色然后共聚焦觀察其在細(xì)胞內(nèi)的定位�？墒前l(fā)現(xiàn)熒光很快就粹滅了，根本無法拍照，用p-EFGP-N3空載體的話好一些。我的實(shí)驗(yàn)過程是：0.4%多聚甲醛固定10分鐘，0.1 triton 透膜5分鐘，DAPI染色20分鐘，期間都是PBS清洗三遍。不知道問題出在哪里！ 再就是用RIPA強(qiáng)裂解細(xì)胞提取總蛋白，用試劑盒分離核和質(zhì)蛋白后進(jìn)行western實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)總蛋白中無法檢測(cè)到EGFP，試劑盒提取的核與質(zhì)蛋白又可以，不知是否是RIPA強(qiáng)導(dǎo)致的EGFP的降解。 先謝謝各位大神了�。。。。。�！ [ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ] |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
材料調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
考研調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
26申博
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
調(diào)劑申請(qǐng)
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
環(huán)境工程297分求調(diào)劑一志愿杭高院
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
070300化學(xué)調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
一志愿085600中科院寧波所276分求調(diào)劑
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
288資源與環(huán)境專碩求調(diào)劑，不限專業(yè)，有學(xué)上就行
已經(jīng)有22人回復(fù)
-
273求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
267求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- Western Blot電泳蛋白質(zhì)外漏問題求助
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教大分子量蛋白western blot轉(zhuǎn)膜的一些問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】極小分子與極大分子蛋白的Western Bloting轉(zhuǎn)膜求助！
已經(jīng)有10人回復(fù)
曾文正公
金蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 4564.3
- 紅花: 6
- 帖子: 1936
- 在線: 626.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 2161228
- 注冊(cè): 2012-12-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+3, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金幣+5, ★有幫助 2013-03-09 19:54:02
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+3, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金幣+5, ★有幫助 2013-03-09 19:54:02
|
我們通常做染色是這樣的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室溫固定15min,PBS洗兩次，0.1% triton in PBS室溫打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗兩次，就可以看了，如果是玻片的話還需要封片。提醒一下，GFP在酸性環(huán)境下熒光會(huì)淬滅的。 你WB方面的問題確實(shí)很奇怪，GFP是很穩(wěn)定的，不應(yīng)該連wb都做不出來。如果你懷疑你的RIPA，那你就從小木蟲上找個(gè)RIPA配方自己配一下，RIPA這東西真覺得沒必要買，自己配的比賣的好多了。希望能幫到你，祝好 |
3樓2013-03-06 17:51:01
jiejiewutong
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 2991.3
- 帖子: 289
- 在線: 35.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 1297795
- 注冊(cè): 2011-05-17
- 專業(yè): 黏膜免疫學(xué)
2樓2013-03-06 17:33:27
kinglovecw
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 587
- 散金: 40
- 紅花: 7
- 帖子: 65
- 在線: 43.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 1293719
- 注冊(cè): 2011-05-12
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
4樓2013-03-09 19:53:00
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
5樓2014-03-13 14:56:04
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 273求調(diào)劑 +8 | 李芷新1 2026-03-31 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿：西北大學(xué)，英一數(shù)一408-284分求調(diào)劑 +7 | 12.27 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
[碩博家園] 求調(diào)劑 有機(jī)化學(xué)考研356分 +11 | Nadiums 2026-03-25 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 0710生物學(xué)求調(diào)劑！ +5 | 敘述文 2026-03-31 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑，一志愿西北工業(yè)大學(xué)，材料工程（085601） +6 | 小小機(jī)靈蟲 2026-03-29 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 330分求調(diào)劑 +6 | qzenlc 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 08工科，295，接受跨專業(yè)調(diào)劑 +4 | lmnlzy 2026-03-31 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué) +20 | 妮妮ninicgb 2026-03-27 | 20/1000 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國科學(xué)院大學(xué)265求調(diào)劑 +6 | 恬淡ye 2026-03-31 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
 304材料求調(diào)劑
+5
|
鐘llll 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600 286分 材料求調(diào)劑 +11 | 麻辣魷魚 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 總分293求調(diào)劑 +8 | 加一一九 2026-03-25 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 327求調(diào)劑 +6 | 汲亦昊 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 340求調(diào)劑 +6 | Amber00 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 蘆lty 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 286求調(diào)劑 +12 | PolarBear11 2026-03-26 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 085600，材料與化工321分，求調(diào)劑 +9 | 大饞小子 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +4 | 小懶蟲不懶了 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +4 | 求求了收下我吧?/a> 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +5 | hanamiko 2026-03-26 | 5/250 |
|