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kinglovecw銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助EGFP蛋白的western及免疫熒光問(wèn)題�。。。�！急急急�。。。。� 已有1人參與
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小弟最近構(gòu)建了一個(gè)EGFP融合表達(dá)的蛋白，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以后，DAPI染色然后共聚焦觀察其在細(xì)胞內(nèi)的定位�？墒前l(fā)現(xiàn)熒光很快就粹滅了，根本無(wú)法拍照，用p-EFGP-N3空載體的話好一些。我的實(shí)驗(yàn)過(guò)程是：0.4%多聚甲醛固定10分鐘，0.1 triton 透膜5分鐘，DAPI染色20分鐘，期間都是PBS清洗三遍。不知道問(wèn)題出在哪里！ 再就是用RIPA強(qiáng)裂解細(xì)胞提取總蛋白，用試劑盒分離核和質(zhì)蛋白后進(jìn)行western實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)總蛋白中無(wú)法檢測(cè)到EGFP，試劑盒提取的核與質(zhì)蛋白又可以，不知是否是RIPA強(qiáng)導(dǎo)致的EGFP的降解。 先謝謝各位大神了�。。。。。�！ [ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ] |
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jiejiewutong
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2樓2013-03-06 17:33:27
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我們通常做染色是這樣的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室溫固定15min,PBS洗兩次，0.1% triton in PBS室溫打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗兩次，就可以看了，如果是玻片的話還需要封片。提醒一下，GFP在酸性環(huán)境下熒光會(huì)淬滅的。 你WB方面的問(wèn)題確實(shí)很奇怪，GFP是很穩(wěn)定的，不應(yīng)該連wb都做不出來(lái)。如果你懷疑你的RIPA，那你就從小木蟲(chóng)上找個(gè)RIPA配方自己配一下，RIPA這東西真覺(jué)得沒(méi)必要買(mǎi)，自己配的比賣(mài)的好多了。希望能幫到你，祝好 |
3樓2013-03-06 17:51:01
kinglovecw
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4樓2013-03-09 19:53:00
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5樓2014-03-13 14:56:04
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