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mahoumeimei金蟲 (小有名氣)
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熒光定量PCR-絕對(duì)定量
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最近想通過定量PCR來(lái)分析不同時(shí)期體系中目標(biāo)微生物的含量變化，主要是針對(duì)DNA做絕對(duì)定量。但看了一些資料后，有一點(diǎn)疑問。 做絕對(duì)定量事先不是需要制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎。資料上是說，通過克隆制備，提取出來(lái)的質(zhì)粒DNA通過分光光度計(jì)測(cè)定濃度，再根據(jù)質(zhì)量信息換算成目標(biāo)基因含量，再稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)基因含量和Ct值的關(guān)系。 可是我不明白，既然通過測(cè)定樣品濃度就可以計(jì)算出目標(biāo)基因的含量，為什么還要多此一舉，做定量PCR呢？或者說，定量PCR的意義不僅僅是這樣，但如果我的目的就是得到目的基因含量的話，其實(shí)是不需要做定量PCR的？ 新手學(xué)習(xí)中，希望大家給點(diǎn)建議。非常感謝！ |
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chenguestc
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mahoumeimei: 金幣+2, 自己已經(jīng)想明白了，不過還是謝謝你的回復(fù): ) 2013-03-07 16:09:55
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-04-26 21:56:20
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做絕對(duì)定量事先不是需要制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎。資料上是說，通過克隆制備，提取出來(lái)的質(zhì)粒DNA通過分光光度計(jì)測(cè)定濃度，再根據(jù)質(zhì)量信息換算成目標(biāo)基因含量，再稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)基因含量和Ct值的關(guān)系。 是的，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 可是我不明白，既然通過測(cè)定樣品濃度就可以計(jì)算出目標(biāo)基因的含量，為什么還要多此一舉，做定量PCR呢？或者說，定量PCR的意義不僅僅是這樣，但如果我的目的就是得到目的基因含量的話，其實(shí)是不需要做定量PCR的？ 你說的方法可以，但是只是在同一時(shí)期時(shí)可以，因?yàn)槟銣y(cè)得總基因組的濃度。 在不同時(shí)期你要考慮時(shí)空表達(dá)問題即不同基因在不同時(shí)期表達(dá)量不一致，即整個(gè)基因組的基因并不都是同一變化規(guī)律及速率，因此，定量PCR可以解決這個(gè)問題。 |
2樓2013-03-07 09:47:25
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4樓2013-04-02 15:09:04
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| “通過克隆制備，提取出來(lái)的質(zhì)粒DNA通過分光光度計(jì)測(cè)定濃度，再根據(jù)質(zhì)量信息換算成目標(biāo)基因含量，再稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)基因含量和Ct值的關(guān)系�！边@里面忽略了一個(gè)問題，就是你的檢測(cè)樣本也要進(jìn)行基因組的提取，然后才能作為模板進(jìn)行pcr定量。此時(shí)出現(xiàn)的一個(gè)問題是，目標(biāo)基因含量和Ct值在一定范圍內(nèi)（即要對(duì)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屪鳛槟０澹┎拍芙⒕�性關(guān)系，從而確定樣本中目標(biāo)基因含量。另外之所以要進(jìn)行PCR，是因?yàn)樗缺稊?shù)放大了目標(biāo)基因的含量，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。 |
5樓2016-01-08 16:15:58
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