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也雨seahorse金蟲 (小有名氣)
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[求助]
酶活性測定 （葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）
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誰有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性在植物組織中怎么測定的方法，麻煩給我一下，謝了，或者是測定Isolation of apoplastic fluids and intracellular soluble fractions這個的方法，越詳細越好。注意是植物組織中的，不用試劑盒的方法。 [ Last edited by wizardfan on 2013-3-10 at 09:43 ] |
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也雨seahorse
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3樓2013-03-13 13:03:39
jzhe961
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【答案】應助回帖
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G6PDH的活性還是很好測的。植物樣品一般是液氮速凍-80下保存， extraction buffer 在研缽研磨成為勻漿，離心后上清直接可以用于酶活測定。 Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) Ref: Adapted from Hauschild, R. and von Schaewen A. (2003) Plant physiol. 133: 47-62 Principle: Oxidation of glucose-6-phosphate to 6-phosphogluconolactone concomitant with reducing NADP to NADPH. The blank rate is recorded in absence of G6P in the assay mix and must be substracted from the G6P reaction rate. Final concentration : Stock concentration : Assay Buffer - Tris-HCl 100mM, pH 8.0 Assay buffer 2X - Tris-HCl 200 mM, pH 8.0 Substrates - G6P 2 mM - NADP 0.2 mM Substrates - G6P 100 mM - NADP 50 mM Before measurements, 30uL of crude extract diluted 10 times was used for 10 min pre-incubation at room To, one sample in the presence of 62.5 mM DTT (final concentration) and another one in the absence of reductant (H20). Contribution of cytosolic and plastidic isoenzymes is based on differential calculation of G6PDH activity measured in the absence (TOTAL) and presence of DTT (CYTOSOLIC): Total minus cytosolic is equal to plastidic activity. Mix everything without sample. Deposit pre-incubated sample in wells and add blank or assay mix to start the reaction Observation: Reduction of NADP at 340 nm, 30°C. |
2樓2013-03-12 22:07:44
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