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wxl.1989822金蟲 (小有名氣)
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[求助]
pET28a載體蛋白表達(dá)為包涵體
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RT 本人最近在做利用pET28a載體表達(dá)純化蛋白，菌是BL21，最近連續(xù)兩次跑膠都是破碎后沉淀有目的條帶，上清非常淡條帶。具體實(shí)驗(yàn)步驟也就是：誘導(dǎo)后菌體4度離心后破碎，不過破碎后我采用的是常溫離心10分鐘左右，會(huì)不會(huì)是因?yàn)檫@樣引起的蛋白被沉淀了？注：誘導(dǎo)采用的是終濃度0.2 0.4 0.6 0.8 1.0的梯度。誘導(dǎo)溫度25和37結(jié)果差不多。 |
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wxl.1989822
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3樓2013-03-16 11:30:59
gaojuan1985
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wxl.1989822: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-03-13 10:38:09
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wxl.1989822: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-03-13 10:38:09
| 可以試試IPTG濃度低一點(diǎn)，誘導(dǎo)溫度16度過夜。此外，破碎后要低溫離心，為什么要常溫離心？常溫離心也不一定會(huì)造成蛋白沉淀，但是如果蛋白不穩(wěn)定的話，會(huì)有降解等風(fēng)險(xiǎn)。如果實(shí)在不可溶的話，要么嘗試包涵體復(fù)性，要么換載體和宿主菌�？梢圆捎肂L21 TrxB菌，同時(shí)載體可以換成帶GST標(biāo)簽或Trx標(biāo)簽等有促溶作用的。 |
2樓2013-03-13 09:42:16
searchman
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試試ArcticExpress Competent Cells，我用的載體和你一樣，蛋白可溶性很好。 http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf |
4樓2013-03-18 01:51:43
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5樓2013-05-18 11:41:12
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