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關(guān)于熒光定量的疑問，請(qǐng)教論壇蟲友
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我是剛接觸熒光定量，現(xiàn)在要做處理組相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)的差異實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)有一步比較迷惑，請(qǐng)教這方面的蟲友 我做的是相對(duì)定量（染料法），理論看了一大堆，我想問一下具體操作的時(shí)候處理組pcr管中加入的模板量需要和對(duì)照組中加入的模板量一樣嗎（注意不是說的目的基因pcr管中的總模板量需要和內(nèi)參的一樣，這個(gè)需要一樣我知道，因?yàn)檫@樣才能用內(nèi)參的來normalized目的基因）？我看一些資料說做之前需要先測(cè)定一下cDNA的濃度，盡量二者的濃度一致較好，我的理解是既然有內(nèi)參進(jìn)行normalized，為什么還需要這一步呢，有懂得蟲友嗎？請(qǐng)教一下。百度里面一些解釋說不用，但又說盡量差異不要太大，也沒有解釋原因，真糾結(jié) |
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【答案】應(yīng)助回帖
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我自己找qPCR融解曲線找到你這個(gè)貼子，我不知道你搞清楚沒 先回答如下吧： 如果你的引物在你所用的反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率是100%，那么模板量沒必要加的完全一樣，甚至可以有大至數(shù)量級(jí)的差異 但是，實(shí)際情況是你的PCR反應(yīng)體系一般不是100%，會(huì)有10%-20%甚至更大的偏差，這時(shí)，如果計(jì)算相對(duì)表達(dá)量時(shí)加入引物擴(kuò)增效率的校正，模板一樣可以有較大差異。但是如果計(jì)算時(shí)沒進(jìn)行校正，或者你根本就沒做引物擴(kuò)增效率的預(yù)實(shí)驗(yàn)，建議你盡量把模板加的比較一致吧（因?yàn)檫M(jìn)行反轉(zhuǎn)時(shí)也要測(cè)定RNA含量才進(jìn)行反轉(zhuǎn)，所以沒必要再對(duì)反轉(zhuǎn)后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，只需同樣倍數(shù)的稀釋就行了）。 順便問個(gè)問題，哪位蟲友清楚一般qPCR產(chǎn)物的融解曲線在哪個(gè)溫度范圍出峰？會(huì)不會(huì)低于80度？ |
2樓2013-08-12 19:17:14
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