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關(guān)于熒光定量的疑問，請教論壇蟲友
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我是剛接觸熒光定量，現(xiàn)在要做處理組相對于對照組基因表達的差異實驗。實驗有一步比較迷惑，請教這方面的蟲友 我做的是相對定量（染料法），理論看了一大堆，我想問一下具體操作的時候處理組pcr管中加入的模板量需要和對照組中加入的模板量一樣嗎（注意不是說的目的基因pcr管中的總模板量需要和內(nèi)參的一樣，這個需要一樣我知道，因為這樣才能用內(nèi)參的來normalized目的基因）？我看一些資料說做之前需要先測定一下cDNA的濃度，盡量二者的濃度一致較好，我的理解是既然有內(nèi)參進行normalized，為什么還需要這一步呢，有懂得蟲友嗎？請教一下。百度里面一些解釋說不用，但又說盡量差異不要太大，也沒有解釋原因，真糾結(jié) |
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【答案】應(yīng)助回帖
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我自己找qPCR融解曲線找到你這個貼子，我不知道你搞清楚沒 先回答如下吧： 如果你的引物在你所用的反應(yīng)體系中擴增效率是100%，那么模板量沒必要加的完全一樣，甚至可以有大至數(shù)量級的差異 但是，實際情況是你的PCR反應(yīng)體系一般不是100%，會有10%-20%甚至更大的偏差，這時，如果計算相對表達量時加入引物擴增效率的校正，模板一樣可以有較大差異。但是如果計算時沒進行校正，或者你根本就沒做引物擴增效率的預(yù)實驗，建議你盡量把模板加的比較一致吧（因為進行反轉(zhuǎn)時也要測定RNA含量才進行反轉(zhuǎn)，所以沒必要再對反轉(zhuǎn)后的產(chǎn)物進行測定，只需同樣倍數(shù)的稀釋就行了）。 順便問個問題，哪位蟲友清楚一般qPCR產(chǎn)物的融解曲線在哪個溫度范圍出峰？會不會低于80度？ |
2樓2013-08-12 19:17:14
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