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zhangjie801284木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
ＤＮＡ凝膠圖片 已有2人參與
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ＤＮＡ提取過(guò)程能否滿足ＰＣＲ的參考1 、CTAB提取液:分別配制2%的(W/V) CTAB,其他成分相同分別為100mmol/ L Tris-HCl(pH=8. 0)，5Ommol/L EDTA pH8.0,1400 mmol/ L NaCl。1%-疏基乙醇，2%-PVP. 2 、CTAB提取緩沖液:100 mL含2gCTAB, 10 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，0.74gEDTA, 8.18 g N aCl, 0.2 mL巰基乙醇。DNA提取液:二氯甲烷與異戊醇的體積比為24：1 3、改良后的CTAB法具體提取步驟如 ( 1)取新鮮葉片1g放入己冷凍的研缽中，加入不溶性的pvp0.2g在液氮中迅速側(cè)h磨成粉末;然后將粉末放入含650 u高盆提取緩沖液1.5ml加入離心管中,加入80u1巰基乙醇，混勻，65℃水浴的75 min其間混勻 2- 3次，取出樣品，冷卻至室溫;(2)加入650u1氯仿/異戊醇(24: 1), 50 u1飽和酚，震蕩混勻，12000 r/min離心lOmin(3)取上清液，移至另一1.5 ml離心管中，再加入700 u 1氯仿屏戊醇( 24: 1),震蕩混勻，12 000 r/min離心10 min(4)取上清液，移至另一15ml,離心管中，加入5mol/LNaC1200u1、加入600 u 1冰凍無(wú)水乙醇，充分混勻，靜置，-20℃沉淀凝聚2h 10 000 r/min,離心lOmin (5)棄上清，加入75%乙醇洗滌2- 3次，最后將沉淀置于40℃烘箱中烘干，加入100ulTE buffer中溶解沉淀，待完全溶解后短暫離心。 4、提取緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl(PH=8.0),20 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1.4 mo1/L NaCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%巰基乙醇.DNA緩沖液:50 mmol/L Tri*-HC1(PH =8.0), 10 mmol/L EDTA. 5、行充分研磨，研磨后粉末迅速放入65℃預(yù)熱的1mL2*CTAB( 2%CTAB; 1.4mol/LNaCl(pH8.0)0.02mo1/LEDTA(pH8.0.);0.lmol/LTris-HCl(PH8.0);0.06mo1/L Vitamin C; 4%琉基乙醇 (用前加))提取緩沖液中 6、 CTAB法提取液:100 mmol/lTris-HC1 (pH 8.0)1.4mol/lNaC1,20 mmol/lEDTA (pII 8.0), 2% CTAB ,2% PV P, 2%琉基乙醇。 6、 7、 8、提取緩沖液2*CTAB:2% CTAB,l00mM Tris-Cl(PH8.0) , 20mM EDTA(PH 8.0),1.4M NaCl，2% Na2Co3 2%PVP,3% 巰基乙醇(使用前加入) 9、 9、 |
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DNA提取方法的探討
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CTAB法： DNA提取Buffer的配制：3% CTAB (W/V)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，0.2% 巰基乙醇。 1） 取0.1克左右新鮮葉片，放入1.5ml離心管中，加入液氮，將葉片研磨成粉末。待離心管中液氮揮發(fā)完全后，迅速加入 600μl CTAB DNA提取Buffer，充分混勻后，于室溫或65℃放置30-60min，每隔10min顛倒一次； 2) 加入1倍體積氯仿/異戊醇，充分混勻，12,000rpm室溫離心15min，取上清； 3) 加入1倍體積異丙醇，晃動(dòng)離心管，使異丙醇與上清液充分混勻，可見(jiàn)白色絮狀DNA析出，12,000rpm室溫離心5min，去上清， 加入 1ml 70%乙醇，于室溫放置30min； 4) 棄上清液，讓沉淀在超靜臺(tái)上吹干或用真空泵抽干，加入100μl SDW，使沉淀完全溶解: 5） 取1μl DNA溶液在0.8%瓊脂糖凝膠上檢查DNA的質(zhì)量并通過(guò)濃度梯度定量； 6） 將其余DNA樣品保存在-20℃?zhèn)溆谩? 酚－氯仿提取法 1. 取液氮冷凍的葉片2-3片， 在液氮冷凍下迅速研磨成粉末。 2. 將粉末放入到1.5 ml離心管中，然后加入緩沖液“S”750ul, 充分混勻。 3. 將離心管置于65℃水浴中1-2小時(shí)，水浴過(guò)程中溫和混勻幾次。 4. 取出離心管, 每管加入等體積的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混勻后離心，10000rpm, 10分鐘。 5. 上清液移入另一離心管中，加入等體積的氯仿，混勻后，10000rpm, 6分鐘。 6. 將上清液移入另一離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置一段時(shí)間，然后用槍頭勾出DNA,并用70％乙醇沖洗2次。 7. 勾出的DNA，真空干燥后將其溶于500ul 1x TE中。 8. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保溫1 小時(shí)。 9. 加入等體積的酚-氯仿溶液, 輕輕混勻后, 10000rpm離心6分鐘。 10. 取上清液，加入等體積的氯仿，輕輕混勻后，10000rpm離心6分鐘。 11. 取上清液，入1/10體積3M醋酸鈉，混勻后，加入2倍體積冷的無(wú)水乙醇（或95％乙醇）。輕輕混勻靜置一會(huì)兒后，用槍頭勾出DNA, 用70％乙醇沖洗2次后，真空干燥。依所提DNA量加入20-50ul的1x TE溶解DNA。 12. 測(cè)定DNA 的濃度，取少量樣品跑電泳, Agarose 膠的濃度為0.8%。 13. 樣品在4℃下保存?zhèn)溆谩?/font> [ Last edited by shanzhuyu on 2007-9-17 at 19:51 ] |
3樓2007-09-17 19:46:58
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4樓2011-03-25 21:04:30
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5樓2019-06-13 16:51:25
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